XA21和PI-D2激酶在酵母系統(tǒng)表達(dá)及其自我磷酸化活性研究.pdf

1、水稻是最重要的糧食作物之一，是全世界一半以上人口的主要糧食來(lái)源。水稻病害的侵染會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收。白葉枯病和稻瘟病是水稻兩大主要病害，對(duì)抗病基因介導(dǎo)的抗病分子機(jī)理研究對(duì)水稻生產(chǎn)具有重要的意義。Xa21是第一個(gè)克隆的水稻抗病基因，對(duì)水稻白葉枯病具有廣譜抗性。其編碼的蛋白質(zhì)是一個(gè)類受體蛋白激酶。劉國(guó)振等對(duì)Xa21編碼蛋白質(zhì)的激酶區(qū)進(jìn)行了系統(tǒng)的生化特性的研究，證明了Xa21編碼一個(gè)有活性的蛋白激酶，是絲/蘇氨酸特異的。稻瘟病是真菌性病害，由異

2、宗配合子囊菌Magnaporthe grisea的無(wú)性世代PricpLaria grisea產(chǎn)生的分生孢子侵染而使水稻致病。Pi-d2抗稻瘟病基因最早在水稻品種地谷中發(fā)現(xiàn)，并定位在第6號(hào)染色體上。經(jīng)圖位克隆法克隆后，發(fā)現(xiàn)Pi-d2也編碼一個(gè)類受體激酶。本試驗(yàn)中，我們將XA21和PI-D2蛋白激酶在真核表達(dá)系統(tǒng)酵母中進(jìn)行了表達(dá)。 (1)通過(guò)釀酒酵母同源重組原理，將目的片斷和pEGH載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母，PCR驗(yàn)證后誘導(dǎo)表達(dá)，純化后獲得了考染可

3、見(jiàn)并具有自我磷酸化活性的蛋白質(zhì)，為兩個(gè)蛋白激酶的大量表達(dá)，進(jìn)而開(kāi)展相關(guān)生化分析奠定了基礎(chǔ)。 (2)利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)XA21和PI-D2蛋白激酶，即利用畢赤酵母分泌型表達(dá)載體構(gòu)建含有目的基因的重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母細(xì)胞中，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選和G418、Zeocin抗性篩選后，再通過(guò)PCR驗(yàn)證重組載體整合到酵母基因組中的情況，將PCR驗(yàn)證過(guò)的陽(yáng)性重組子用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最后通過(guò)SDS-PAGE及Western Blot