mP24假定蛋白的CK2磷酸化活性測定.pdf

1、蛋白激酶CK2（CaseinKinase2）是一種真核細(xì)胞中普遍存在且高度保守的信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生存、生長、增殖及凋亡過程中具有重要的功能，同時它與腫瘤的發(fā)生有一定相關(guān)性。mp24是一個鼠源的新基因，功能未知。它與本課題組前期研究中的具有CK2激酶活性的人源新基因hp23氨基酸序列具有78％的同源性。為了檢測mP24假定蛋白是否也具有CK2激酶活性，本實驗通過檢測表達(dá)外源mP24蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠NIH3T3細(xì)胞的m

2、P24免疫沉淀產(chǎn)物的磷酸化活性，來探討mP24可能的生物學(xué)功能。
　　本實驗對網(wǎng)上mp24序列進(jìn)行了確認(rèn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由小鼠NIH3T3細(xì)胞獲得的mp24基因序列與NCBI序列相差2個堿基，經(jīng)分析證實其中一個為鼠源的單核苷酸多態(tài)（SNP）。生物信息學(xué)分析顯示：mP24具有4個CK2的磷酸化作用位點，1個PKC的磷酸化作用位點以及2個N-肉豆蔻基化作用位點。
　　構(gòu)建了能夠表達(dá)mP24-V5融合蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/

3、mp24，利用瞬時轉(zhuǎn)染獲得表達(dá)mP24-V5融合蛋白的小鼠NIH3T3細(xì)胞。利用V5抗體的細(xì)胞免疫熒光方法將mP24-V5融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，線粒體以及細(xì)胞核。
　　利用UpState公司的CK2激酶活性檢測試劑盒，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/mp24的小鼠NIH3T3細(xì)胞的V5免疫沉淀產(chǎn)物為實驗材料，分別從mP24作為CK2激酶本身以及CK2激酶磷酸化底物兩個方面對mP24的磷酸化活性進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果證實：mP24極有可能