P21激活的磷酸化蛋白激酶5在牙周病中的細胞功能探索.pdf

1、研究背景：細胞內大部分重要的生命過程，如代謝、物質轉運、黏附、生長、發(fā)育、調亡、肌肉收縮、免疫細胞激活、神經(jīng)活動、應激反應以及腫瘤疾病的發(fā)生都涉及蛋白磷酸化，而且這種可逆性的蛋白磷酸化也是多種信號轉導途徑中的重要環(huán)節(jié)。在可逆性的蛋白磷酸化過程中，涉及兩個相反的過程和兩種作用相反的物質：蛋白激酶介導的磷酸化和磷酸酶介導的去磷酸化。蛋白激酶是一類磷酸轉移酶，其作用是將γ-ATP的磷酸基團轉移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質磷酸化，發(fā)揮其生

2、理生化功能。蛋白激酶在口腔細胞信號轉導及牙周病中的功能在近十年內才有了較多的認識和研究。P21激活的磷酸化蛋白激酶(PAKs)是一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為Rho家族中小GTP酶，Rac和Cdc42下游的效應因子以及MAPK信號通路上游的調控因子，包括2個亞家族(PAKI和PAKII)，6個家族成員(PAK1-6)。PAKs在調節(jié)細胞生長、增殖、分化、基因調節(jié)，細胞骨架重排以及細胞調亡等過程中起到重要作用。PAK5是一種最

3、近被證實而且很少被了解的p21激活的磷酸化蛋白激酶家族成員之一，在結構上與PAK4類似，屬于PAKII亞家族。研究表明蛋白激酶在口腔細胞中參與重要的功能調節(jié)，如參與牙周膜細胞的成骨分化，牙槽骨代謝通路的調節(jié)以及在放線伴放線桿菌感染的牙周炎時參與口腔上皮細胞調亡的調控等。但是目前還沒有文獻報道對PAKs家族在口腔細胞及牙周病中細胞生物學方面的研究，本實驗試圖建立PAK5與口腔細胞尤其是牙周細胞生物學功能的聯(lián)系，為牙周病的發(fā)病機制的研究甚至

4、治療提供實驗材料。 研究目的：通過基因重組技術，克隆PAK5氨基端基因，構建pGEX-4T-1-PAK5氨基端表達載體，誘導其在E.coli中表達，純化蛋白表達產物并制備多克隆抗體，為進一步研究PAK5在口腔細胞中相互作用蛋白及其在相關信號轉導通路中的作用提供重要的研究基礎。 研究方法：(1)PAK5氨基端基因片斷的擴增與克隆。利用人類cDNA文庫中PAK5全基因序列，設計引物，RT-PCR擴增氨基端基因，將擴增產物克隆

5、至pGEX-4T-1載體中，經(jīng)EcoRI/XhoⅠ雙酶切后進行重組質粒鑒定，DAN測序。(2)蛋白的表達、純化，多克隆抗體制備及鑒定。pGEX-4T-1-PAK5氨基端重組質粒轉化E.coliBL21受體菌、氨芐青霉素平板篩選、挑選陽性克隆、IPTG小量誘導后，挑選被誘導的菌株進行大量誘導。蛋白產物由GST-融合蛋白純化系統(tǒng)純化。最后得到的純化蛋白粗略定量后送與抗體制備。Westernblotting對所得抗體進行檢測。(3)PAK5在

6、口腔細胞中的表達。Westernblotting及細胞免疫熒光染色鑒定PAK5在牙胚細胞中的表達。Westernblotting鑒定部分牙周病患者齦溝液中PAK5的表達。 結果：(1)成功克隆了PAK5氨基端基因，構建了pGEX-4T-1-PAK5氨基端重組質粒，經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳及DNA測序證明克隆基因與目的基因相符。(2)pGEX-4T-1-PAK5氨基端重組質粒在轉化E.coliBL21受體菌后

7、，在IPTG誘導下中成功表達了目的蛋白。利用GST-融合蛋白純化系統(tǒng)得到了純化的目的蛋白，通過免疫家兔制備了多克隆抗體，并經(jīng)親和層析柱純化了抗體。(3)。Westernblotting結果及細胞免疫熒光染色表明，PAK5在牙胚細胞中過度表達。部分牙周病病人的齦溝液中也可以檢測到PAK5的表達。 結論：(1)利用基因重組技術，成功克隆了PAK5氨基端基因，表達并純化了的目的蛋白，制備了多克隆抗體，為進一步研究PAK5在口腔細胞中的