流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞磷酸化信號(hào)蛋白在兒童白血病中的應(yīng)用和分子靶向治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　急性白血?。╝cute leukemia,AL)是兒童期發(fā)病首位的惡性腫瘤，以學(xué)齡前期兒童多見。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國(guó)0-10歲兒童白血病的發(fā)病率約為3/10萬(wàn)-4/10萬(wàn)，嚴(yán)重威脅著兒童的健康和生命。由于新型藥物的應(yīng)用及治療方案的完善，急性白血病，尤其是急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)完全緩解（CR）率已達(dá)到95％以上，5年以上持續(xù)完全緩解（CCR）率可達(dá)65%-80%。但對(duì)于部分急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）和難治性AL

2、L，提高他們的長(zhǎng)期生存率仍是目前的一大難題。
　　白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥以及白血病復(fù)發(fā)是治療失敗的重要原因。而在評(píng)價(jià)白血病患兒預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)中，除基因突變等細(xì)胞遺傳學(xué)改變與ALL的預(yù)后關(guān)系比較肯定外，一些用于評(píng)價(jià)的臨床和治療反應(yīng)指標(biāo)與預(yù)后之間還缺乏直接的對(duì)等關(guān)系。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，白血病中存在Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和/或Ras/Raf/MEK/ERK關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的擾亂，這些通路與白血病發(fā)生、白血病細(xì)胞增殖、

3、細(xì)胞凋亡抑制和細(xì)胞耐藥相關(guān)。因此我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，利用磷酸化流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)這兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的磷酸化蛋白p-Akt T308、p-Akt S473和p-ERK1/2，對(duì)它們與白血病臨床表現(xiàn)、危險(xiǎn)分級(jí)和治療反應(yīng)之間的關(guān)系作進(jìn)一步研究。
　　磷酸化流式細(xì)胞術(shù)能檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中磷酸化信號(hào)蛋白的表達(dá)，雖然具有較高的敏感性和可重復(fù)性，但是不能提供腫瘤細(xì)胞對(duì)外界刺激的動(dòng)態(tài)反應(yīng)。部分患者即使存在相關(guān)基因或上游酪激酶受體的突變，

4、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍處于靜止?fàn)顟B(tài)。單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)圖（single cell network profiling,SNCP）是在磷酸化流式細(xì)胞術(shù)的基礎(chǔ)上，用細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等胞外調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，觀察細(xì)胞磷酸化蛋白狀態(tài)的改變，從而能對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行動(dòng)態(tài)的觀察。干細(xì)胞因子（Stem Cell Factor,SCF）和FMS相關(guān)酪氨酸激酶3（FMS-related tyrosine kinase，F(xiàn)LT3）屬于三型酪氨酸激酶受體，在存在FLT3和/

5、或c-KIT突變的病例中能上調(diào)p-Akt和p-ERK1/2的表達(dá)，因此我們采用SCF和FLT3對(duì)標(biāo)本進(jìn)行刺激，從而觀察個(gè)體的異質(zhì)性。
　　目前兒童白血病的治療主要以化療為主并輔以相應(yīng)的支持治療，必要時(shí)行骨髓移植。效果顯著的同時(shí)帶來(lái)一定的不良反應(yīng)，甚至威脅到患者的生命。而部分患者因?yàn)閷?duì)化療藥物耐藥，最終導(dǎo)致化療失敗。研究證明化療聯(lián)合分子靶向治療能提高某些藥物的效應(yīng)，糾正耐藥，并且降低化療藥的使用濃度，以較低的強(qiáng)度達(dá)到相同的治療效果，

6、從而減少化療相關(guān)不良反應(yīng)。但分子靶向藥物和何種化療藥物搭配能達(dá)到最佳的治療效果，是否每一種化療藥物和分子靶向藥物都能起到協(xié)同作用，這仍需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。因此我們采用K562細(xì)胞株，對(duì)Ras/PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路與耐藥之間的關(guān)系和分子靶向治療的應(yīng)用做初步的研究。
　　目的：
　　1.采用本實(shí)驗(yàn)室前期研究所建立的磷酸化流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)白血病患兒骨髓或外周血細(xì)胞磷酸化蛋白p-Akt T

7、308、p-Akt S473和p-ERK1/2的表達(dá)，分析Ras/PI3K/PTEN/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK通路與患兒臨床表現(xiàn)、ALL危險(xiǎn)度分型和治療反應(yīng)之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討phospho-flow技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　2.采用SCNP了解個(gè)體的異質(zhì)性；
　　3.采用AnnexinⅤ/PI凋亡檢測(cè)方法，探討K562細(xì)胞株在Ras/PI3K/PTEN/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK通路激活或抑制的

8、狀態(tài)下對(duì)化療藥物的敏感性，以及不同的分子靶向藥物和化療藥物搭配的治療效果。
　　方法：
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)磷酸化蛋白
　　1.1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白血病患兒骨髓白血病細(xì)胞的磷酸化蛋白細(xì)胞因子作用
　　取100μl骨髓或外周血，分別加入終濃度為20μg/mL的FLT3或終濃度為10μg/mL的SCF，37℃水浴分別作用3.5分鐘和2分鐘。
　　細(xì)胞的固定和破膜
　　裂解紅細(xì)胞同時(shí)固定白血病細(xì)胞：每管加

9、入紅細(xì)胞裂解\固定1×buffer2ml，在37℃水浴中作用10分鐘（根據(jù)BD公司試劑說(shuō)明書）；
　　細(xì)胞破膜：每管加入1ml含90%甲醇的破膜工作液，將細(xì)胞管置于-20℃冰箱中孵育30min(根據(jù)BD公司試劑說(shuō)明書)。
　　細(xì)胞的熒光抗體標(biāo)記
　　（1）加入細(xì)胞表面CD抗體，識(shí)別幼稚細(xì)胞群：
　　B-ALL: CD45-PerCP/CD10-FITC/CD19-PE/CD34-APC
　　AML: CD4

10、5-PerCP/CD13-FITC/CD33-PE/CD34-APC CD45-PerCP/HLA-DR-FITC/CD33-PE/CD34-APC CD45-PerCP/CD15-FITC/CD14-PE/CD34-APC
　　T-ALL:CD45-PerCP/CD5-FITC/CD7-PE/CD34-APC CD45-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE/CD34-APC
　?。?）細(xì)胞內(nèi)磷酸化抗體標(biāo)記：
　

11、　對(duì)照管：CD45-PerCP/IGG1-Alexa488/IGG1-PE/IGG1-Alexa647；
　　磷酸化蛋白檢測(cè)管：CD45 PerCP/p-ERK1/2-Alexa488/p-Akt T308-PE/p-Akt S473-Alexa647
　?。ǜ鶕?jù)每個(gè)患者白血病細(xì)胞表達(dá)的免疫標(biāo)志調(diào)整磷酸化抗體與CD抗體的組合）
　　1.2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞的磷酸化蛋白
　　細(xì)胞因子作用
　　取細(xì)胞

12、密度為1×106/ml的K562細(xì)胞1ml，分別加入終濃度為20μg/mL的FLT3或終濃度為10μg/mL的SCF，37℃水浴分別作用3.5分鐘和2分鐘。
　　細(xì)胞的固定和破膜
　　細(xì)胞固定：每管加入含16%細(xì)胞甲醛的CytoFix細(xì)胞固定液，使甲醛的終濃度為4%，在37℃水浴中孵育10分鐘；
　　細(xì)胞破膜：每管加入1ml細(xì)胞破膜Ⅲ工作液，將細(xì)胞管置于-20℃冰箱中作用30min。
　　細(xì)胞的熒光抗體標(biāo)記

13、>　　對(duì)照管： IGG1-Alexa488/IGG1-PE/IGG1-Alexa647；
　　磷酸化蛋白檢測(cè)管： p-ERK1/2-Alexa488/p-Akt T308-PE/p-Akt S473-Alexa647
　　2、磷酸化蛋白不同狀態(tài)下K562細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性
　　⑴不加刺激劑和抑制劑的K562細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞，加入U(xiǎn)0126、LY294002和雷帕霉素的細(xì)胞作為抑制劑組，加入佛波酯（Phorbol-12-

14、myristate-13-acetate，PMA）的細(xì)胞作為刺激劑組。
　　⑵將每組細(xì)胞分別加入各孔中，每孔50μL；分別加入DNR0.45μg/ml，Ara-C1.95μg/ml，對(duì)照組不加藥；
　　⑶37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)；
　?、任〖?xì)胞懸液100μl，分別加入AnnexinⅤ和PI個(gè)各5μl（根據(jù)BD公司試劑說(shuō)明書）；
　?、苫靹?，室溫避光孵育15分鐘。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)分析磷酸

15、化蛋白
　　采用FACSCanto流式細(xì)胞儀分析，K562細(xì)胞株采用FSC/SSC聯(lián)合設(shè)門，白血病患兒骨髓或外周血采用CD45/SSC聯(lián)合設(shè)門分析磷酸化蛋白p- Akt T308、p-Akt S473和p-ERK1/2的表達(dá)。
　　凋亡檢測(cè)采用陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品及單標(biāo)AnnexinⅤ和PI，確定陽(yáng)性區(qū)域，分析K562細(xì)胞不同磷酸化蛋白狀態(tài)下，化療藥物作用的凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1.39例ALL有21例（58.9%）,

16、31例非M3 AML有29例（93.5%），2例混合白血?。?00%）表達(dá)一種及以上磷酸化蛋白；ALL和AML的陽(yáng)性率，p＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　2.39例ALL患兒各種磷酸化蛋白的陽(yáng)性率：p-Akt T30852.6%，p-Akt S47336.1%，p-ERK1/240.7%；
　　31例非M3 AML患兒各磷酸化蛋白的陽(yáng)性率：p-Akt T30877.3%，p-Akt S47328.6%，p-ERK1/26

17、0.0%；
　　p- Akt T308、p- Akt S473和p-ERK1/2陽(yáng)性率在ALL和AML之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　3. p-Akt T308在ALL和AML中的表達(dá)水平：p-Akt T308在ALL的陽(yáng)性表達(dá)水平為（22.19±11.61）%，在AML為（42.66±25.29）%，p＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　p-Akt S473和p-ERK1/2的表達(dá)水平在ALL和AML之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；

18、>　　4. ALL患兒p-Akt T308表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組白細(xì)胞的水平：陽(yáng)性組為（164.62±100.56）×109/ml，陰性組為（27.41±12.97）×109/ml，p<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　p-Akt S473和p-ERK1/2陽(yáng)性組和陰性組的WBC無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　5. ALL高危組和低危組患兒p-Akt S473表達(dá)水平分別為（14.59±6.48）%和（1.25±1.44）%，p-Akt T

19、308為（18.55±13.84）%和（1.23±0.06）%，p-ERK1/2為（19.26±18.43）%和（2.53±0.05）%，p<0.05，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相關(guān)系數(shù)等于1，p<0.01；
　　6.磷酸化蛋白表達(dá)陽(yáng)性與患兒治療反應(yīng)之間的關(guān)系：ALL患兒中2個(gè)以上磷酸化蛋白表達(dá)陽(yáng)性與患兒早期治療反應(yīng)不佳之間存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.668，p<0.05。非M3 AML患兒中2個(gè)以上磷酸化蛋白陽(yáng)性與患兒第1次誘導(dǎo)失敗之間

20、存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)等于1，p＜0.01；
　　7.三型酪氨酸激酶受體FLT3和SCF能誘導(dǎo)K562細(xì)胞和白血病患兒腫瘤細(xì)胞p-Akt T308，p-Akt S473和p-ERK1/2活化或活性增強(qiáng)。應(yīng)用SCNP能觀察到靜態(tài)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)反應(yīng)；
　　8.磷酸化蛋白不同狀態(tài)下K562細(xì)胞對(duì)藥物的凋亡率：DNR誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)中，PMA組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率分別為（23.40±2.78）%和（58.50±0.57）%；p＜0.05；U0

21、126組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（89.70±3.12）%和（58.50±0.57）%，p＜0.05；LY296002組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（79.70±1.26）%和（58.50±0.57）%，p＜0.05；rapamycin組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（88.60±2.04）%和（58.50±0.57）%，p＜0.05；Ara-C誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)中，PMA組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率分別為（48.10±2.83）%和（65.15±0.21）%，p

22、＜0.05；U0126組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（63.80±0.15）%和（65.15±0.21）%，p＞0.05；LY296002組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（72.60±2.07）%和（65.15±0.21）%，p＜0.05；rapamycin組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（82.50±0.33）%和（65.15±0.21）%，p＜0.05。
　　9. Ara-C對(duì)p-ERK1/2抑制劑組細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡率和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率無(wú)明顯差異。

23、r>　　全文結(jié)論：
　　1.兒童白血病細(xì)胞存在磷酸化蛋白p-Akt T308，p-Akt S473和p-ERK1/2的表達(dá)；
　　2. p-Akt T308在AML中的表達(dá)水平較ALL高，可作為預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)之一；
　　3.白血病細(xì)胞磷酸化信號(hào)蛋白p-Akt T308，p-Akt S473和p-ERK1/2可作為ALL危險(xiǎn)度分型的指標(biāo)之一；
　　4. AL患兒存在2個(gè)及以上磷酸化信號(hào)蛋白表達(dá)與治療反應(yīng)不佳相關(guān)；