多參數(shù)流式細胞術(shù)聯(lián)合WT1檢測早期MRD在急性髓系白血病中的預(yù)后分析.pdf

1、目的：探討初治急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者誘導(dǎo)治療后獲得首次骨髓形態(tài)學(xué)完全緩解（complete remission，CR1）時，采用多參數(shù)流式細胞術(shù)（multiparameter flow cytometry，MFC）及Wilms瘤基因1（Wilms tumor1 gene，WT1）表達檢測微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD），通過檢測MFC-LAIP聯(lián)合

2、WT1的水平變化，對AML患者進行無復(fù)發(fā)生存（relapse-free survival，RFS）、總體生存率（overall survival，OS）等預(yù)后分析，以期指導(dǎo)臨床后續(xù)治療。
　　方法：⑴骨髓（bone marrow，BM）標(biāo)本來自AML患者。診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)。對所有患者初治及CR1后的BM樣本進行MFC-LAIP（leukemia

3、associated immunophenotype）及WT1表達水平檢測。在骨髓細胞水平進行的實驗。所用標(biāo)本均來源于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科因診療需要抽取的BM（獲得患者知情同意）。⑵每例患者在初治及CR1后取BM2-4ml，用FC500(Beckman公司) MFC檢測抗原表達及原始細胞計數(shù)，數(shù)據(jù)分析用CXP Analysis軟件。每個組合補償設(shè)定用未標(biāo)記的同型對照。檢測前行 Flow-check測試激光和補償?shù)姆€(wěn)定性。MFC進行

4、免疫表型分析。單克隆抗體主要包括：CD45-PC7，CD38-FITC，CLL-1-PE， CD34-PC5， CD7-FITC， cMPO-PE， CD19-PC5， CD34-FITC， CD11b-PE，CD15-PC5， CD56-PE， CD117-PC5。同時采用實時定量熒光 PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測WT1。⑶MFC分析以前

5、向角/側(cè)向角（forward scatter/side scatter，F(xiàn)SC/SSC）射門去除死細胞和碎片，每管至少獲取10萬個細胞，以CD45和SSC(CD45/SSC)射門?；颊吖撬杓毎旧栃詾榭乖磉_超過20％的 CD45/SSC細胞群，評估的最低有效細胞數(shù)是40?？乖磉_強度以陽性細胞群的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)來確定，評估的最低有效細胞數(shù)是500。若在篩選時白血病細胞出

6、現(xiàn)的區(qū)域內(nèi)仍有細胞存在且表型異常，即判斷為殘留白血病細胞，以這些殘存的細胞占骨髓有核細胞總數(shù)的比例作為 MRD的數(shù)值。MRD定量值≤10-4與為陰性，≥10-4之為陽性。⑷WT1表達以歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)公認的比值法計算，用RT-qPCR測定WT1和ABL基因，以ABL基因為內(nèi)參。WT1/ABL×10000>60為高表達，＜60為低表達。
　　結(jié)果：①179例初治AML患者中，男88例，女91例，中位年齡47歲（15-73）歲，依據(jù)WH

7、O（2016）分型：AML伴t(8;21)29例，AML伴t(16;16)/inv(16)9例，AML伴inv(3)/t(3;3)1例，M05例，M112例，M215例，M453例，M4EO4例，M525例， M64例，AML伴骨髓增生異常相關(guān)改變11例，治療相關(guān)AML11例。依據(jù)NCCN(2017)指南：低危37例，中危117例，高危25例。中位隨訪時間為23月（6-76）月，目前共100例患者復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)多發(fā)生在CR1后2年內(nèi)，76例

8、早期復(fù)發(fā)（≤12個月）。死亡62例，其中55例死于復(fù)發(fā)。中位RFS21月（4-75月），中位OS28月（6-76月）。②在73例 AML患者中分析 C型凝集素樣受體-1（C-type lectin-like receptor-1，CLL-1）在MRD檢測中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，CLL-1表達在正常對照骨髓細胞的粒細胞、單核細胞，不表達在淋巴細胞、有核紅細胞和CD34+CD38-細胞；在91.8%AML患者白血病細胞和粒細胞、單核細胞表達，在

9、CD34+CD38-細胞表達陽性率為71.2%，且在疾病CR前后表達穩(wěn)定，而在CD34+與CD34-AML患者中表達無差異（P=0.43）。③骨髓形態(tài)學(xué)CR后107例患者MFC-LAIP轉(zhuǎn)陰，72例患者MFC-LAIP仍為陽性。MFC-LAIP陽性患者與陰性患者一般特征相比，發(fā)病時外周血白細胞計數(shù)、BM、MFC及外周血原始細胞比例更高，血小板計數(shù)更低，多為合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。╟entral nervous system leukem

10、ia，CNSL）、高白細胞計數(shù)、治療相關(guān)、中高危患者，初次誘導(dǎo)CR率低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）， MFC-LAIP陽性患者2個療程未CR比例明顯多于陰性患者（P=0.029），RFS、OS明顯縮短（24月 vs11月，35.5月 vs21月，P＜0.001）。④73例AML患者中，57例（78.1%）患者初診WT1高表達，16例（21.9%）患者初診WT1表達不高，其中9例在CR1后WT1高表達，低、中、高危分別2例、

11、4例、3例，老年患者4例，7例發(fā)生早期復(fù)發(fā)。WT1表達水平與外周血白細胞計數(shù)、血紅蛋白濃度、血小板計數(shù)、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、β2微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）、預(yù)后分層無相關(guān)關(guān)系。⑤多因素分析發(fā)現(xiàn)MFC-LAIP、WT1水平為影響AML患者RFS、OS的獨立因素。分析不同危險度分層患者，發(fā)現(xiàn) MFC-LAIP水平為影響中危、高?；颊逺FS的獨立因素；中?；颊逴S的獨

12、立影響因素，而不是低?；颊逺FS、OS的獨立影響因素。⑥評估MFC-LAIP、WT1水平在AML患者預(yù)測復(fù)發(fā)、評估預(yù)后中的效能。發(fā)現(xiàn)MFC-LAIP≥1.35%組與＜1.35%組相比5年RFS率明顯降低（P<0.001），該界值的靈敏度為0.575，特異度為0.818；MFC-LAIP≥1.70%組與＜1.70%組相比5年OS顯著降低（P<0.001），靈敏度為0.714，特異度為0.769。CR1后WT1水平≥40患者與＜40患者相比

13、18月RFS明顯降低（P=0.049），CR1后WT1水平≥50與＜50患者相比，20月的OS明顯降低（P=0.02）；MFC聯(lián)合WT1表達檢測CR1后MRD可提高AML患者預(yù)測RFS、OS的靈敏度，而不影響特異度。進一步亞組分析不同療程達CR患者，發(fā)現(xiàn)仍可提高靈敏度，不影響特異度，但權(quán)重不同。
　　結(jié)論：⑴CR1后MFC-LAIP是影響AML患者RFS、OS的獨立因素，可能對CR后分層治療扮演重要甚至主導(dǎo)角色，但在不同危險度分層