重組蛋白TFPR1的佐劑活性研究及其在酵母系統(tǒng)中的表達(dá).pdf

1、TFPR1是竹葉青（Trimeresurus flavoviridis）蛇毒CRISPs家族蛋白Triflin的N端PR-1結(jié)構(gòu)域，由163個(gè)氨基酸殘基組成。我們?cè)谝郧暗难芯恐?，采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了該P(yáng)R-1結(jié)構(gòu)域，并命名為TFPR1蛋白;而且我們發(fā)現(xiàn)TFPR1蛋白對(duì)蛋白類抗原具有免疫佐劑活性，可能是一種新型蛋白佐劑。本研究主要針對(duì)TFPR1蛋白對(duì)不同類型的小分子多肽抗原的免疫增效作用及機(jī)制進(jìn)行深入研究。同時(shí)，針對(duì)原核系統(tǒng)表達(dá)的重

2、組TFPR1蛋白存在復(fù)性困難和活性低的問(wèn)題，探索采用酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)。
　　1.表達(dá)TFPR1的基因工程菌及重組TFPR1蛋白的穩(wěn)定性分析
　　(1) pET-TFPR1質(zhì)粒的穩(wěn)定性及表達(dá)TFPR1的穩(wěn)定性分析:對(duì)保存2年的甘油菌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定目的基因無(wú)突變，證明長(zhǎng)期保存的表達(dá)TFPR1的基因工程菌具備良好的穩(wěn)定性;對(duì)重組蛋白TFPR1的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及復(fù)性條件進(jìn)行分析，結(jié)果表明TFPR1的表達(dá)具備穩(wěn)定性。

3、
　　(2)不同條件下貯存的重組蛋白TFPR1穩(wěn)定性分析:在無(wú)防腐劑和穩(wěn)定劑條件下，同一批次溶于PBS的重組蛋白TFPR1溶液分別保存在室溫和-20℃，在不同時(shí)間（3、12和18個(gè)月）時(shí)，采用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。結(jié)果證明重組蛋白TFPR1的保存具備較好的穩(wěn)定性，適于長(zhǎng)期保存。
　　2.重組蛋白TFPR1對(duì)不同特性多肽類抗原的免疫增效作用分析
　　(1)重組蛋白TFPR1能夠增強(qiáng)不同特性多肽抗原的免疫原性，但

4、作用強(qiáng)度有所不同:將重組蛋白TFPR1與三種不同特性的多肽(HIV-1 CBD、HIV-1 MPER、HIV-1 Env197-232)分別進(jìn)行混合，無(wú)需偶聯(lián)，于末次免疫后14天采血，檢測(cè)血清抗體滴度及抗體亞類。結(jié)果表明重組蛋白TFPR1能夠顯著增強(qiáng)三種不同特性的多肽(HIV-1 CBD、HIV-1 MPER、HIV-1 Env197-232)的免疫原性，并且能夠誘導(dǎo)引起Th1型偏倚的Th1/Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)，且高于鋁佐劑，TFPR

5、1對(duì)HIV-1MPER多肽的免疫增強(qiáng)作用最弱。
　　(2)重組蛋白TFPR1的佐劑活性與多肽抗原自身特性有關(guān):通過(guò)分析多肽抗原的極性、疏水性和分子量等特性與TFPR1作用強(qiáng)度的關(guān)系，初步發(fā)現(xiàn)多肽抗原的極性可能是影響TFPR1佐劑活性的主要因素，疏水性和分子量也是較為重要的影響因素。
　　3.重組蛋白TFPR1發(fā)揮免疫佐劑增效作用的機(jī)制研究
　　(1)重組蛋白TFPR1在小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)活性研究:檢測(cè)肌肉注射TFPR1小

6、鼠不同時(shí)間血清及注射局部肌肉組織中的細(xì)胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFPR1可激活小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-10及IFN-γ。
　　(2)重組蛋白TFPR1在小鼠體外激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子:無(wú)菌分離小鼠脾細(xì)胞，加入重組蛋白TFPR1體外培養(yǎng)24小時(shí)后收集上清，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子。結(jié)果表明重組蛋白TFPR1能夠在體外激活小鼠免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6、IL-10及IFN-γ。
　　(3)重組蛋白TFPR1

7、與抗原遞呈細(xì)胞的結(jié)合:采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組蛋白TFPR1與小鼠免疫細(xì)胞的結(jié)合情況，結(jié)果顯示重組蛋白TFPR1主要與B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞結(jié)合，同時(shí)也能夠與T細(xì)胞及其他細(xì)胞少量結(jié)合。
　　4.重組蛋白TFPR1在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)及活性分析
　　(1)重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建:克隆構(gòu)建質(zhì)粒pPICZαA-TFPR1并酶切及測(cè)序鑒定，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母系統(tǒng)野生型菌株X33，博來(lái)霉素加壓挑選陽(yáng)性克隆。
　　(2) TFPR1在畢赤酵

8、母系統(tǒng)中的表達(dá)與鑒定:采用ELISA法篩選高表達(dá)菌株，采用SDS-PAGE及Western blot確定表達(dá)蛋白的分子量及其表達(dá)產(chǎn)物的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TFPR1以分泌形式在畢赤酵母系統(tǒng)中成功表達(dá)。
　　(3)酵母系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白TFPR1生物學(xué)活性的分析:以小鼠脾細(xì)胞為模型，檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的激活作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFPR1能夠激活小鼠免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ及IL-10，初步證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物具備生物學(xué)活性。

9、　　(4)酵母系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白TFPR1佐劑活性分析:以雌性BALB/c小鼠為研究對(duì)象，對(duì)酵母系統(tǒng)表達(dá)TFPR1的佐劑活性進(jìn)行初步分析，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFPR1與多肽類抗原HIV CBD簡(jiǎn)單混合免疫小鼠即能夠在短時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)多肽抗原HIV CBD的免疫原性，初步證明表達(dá)產(chǎn)物具備佐劑活性。
　　5.結(jié)論
　　本研究首先分析了TFPR1重組表達(dá)基因工程菌及重組蛋白TFPR1的穩(wěn)定性特征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原核表達(dá)的重組蛋白TFPR1在長(zhǎng)

10、期保存中穩(wěn)定性好。其次，以三種不同特性的多肽抗原為基礎(chǔ)，系統(tǒng)進(jìn)行了重組蛋白TFPR1對(duì)小分子多肽抗原免疫增效作用的研究。研究發(fā)現(xiàn)，重組TFPR1蛋白對(duì)三種不同特性的多肽類抗原均具有免疫增強(qiáng)作用，但對(duì)不同極性特征的多肽的免疫增效作用強(qiáng)度不同。實(shí)驗(yàn)研究表明重組TFPR1蛋白可能通過(guò)結(jié)合B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞，從而激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子而發(fā)揮佐劑活性。最后，本研究采用畢赤酵母系統(tǒng)成功獲得以可溶性形式表達(dá)且具有活性的重組蛋白TFPR1