貓干擾素omega基因的可溶性表達(dá)及其重組蛋白純化方法和活性的研究.pdf

1、貓干擾素omega(FeIFN-ω)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤活性和具有免疫增強(qiáng)作用的細(xì)胞因子。為了研制我國貓干擾素生物制劑及干擾素佐劑，并為研究FeIFN-ω的蛋白結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)，本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已克隆出的五個(gè)FeIFN-ω基因序列，在其成熟肽和終止密碼子序列間分別設(shè)計(jì)了含Bam HI和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的一對通用引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法對這五個(gè)新亞型FeIFN-ω進(jìn)行了亞克隆。擴(kuò)增的目標(biāo)PCR產(chǎn)物純化回收后，經(jīng)Bam

2、HI和Hind Ⅲ雙酶切，插入含有T7啟動子的pET-His表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞，以含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，篩選陽性克隆，并對重組子進(jìn)行了Barn HI和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，PCR鑒定和測序鑒定，獲得構(gòu)建成功的五個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-His/FeIFN-ω1、pET-His/ FeIFN-ω2、pET-His/ FeIFN-ω3、pET-His/ FeIFN-ω4和pET-His/ FeIFN-ω

3、5。再將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化OrigamiB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，以含氨芐青霉素的LB平板篩選鑒定重組質(zhì)?；蚬こ叹?。經(jīng)過低溫，低濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體、超聲波裂解、低溫高速離心收集上清，采用Ni-NTA親和層析純化r FeIFN-ω，再經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測，分析純化的重組蛋白。并且在貓腎上皮細(xì)胞(CRFK)-水泡性口炎病毒(VSV)系統(tǒng)上，采用細(xì)胞病變抑制法測定rFeIFN-ω的抗病毒活性

4、。 結(jié)果表明，本研究成功地亞克隆了五個(gè)新亞型的FeIFN-ω基因。缺少信號肽序列的FeIFN-ω1基因全長540bp，無內(nèi)含子，編碼180個(gè)氨基酸組成的成熟多肽；而FeIFN-ω2、FeIFN-ω3、FeIFN-ω4、FeIFN-ω5基因全長均為519bp，編碼173個(gè)氨基酸組成的成熟多肽。所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET-His/FeIFN-ω(1-5)在OrigamiB(DE3)基因工程菌中能可溶地表達(dá)分子量約為21kDa的融合蛋白，