重組可溶性人干擾素-γ工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化.pdf

1、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)是由抗原刺激T細胞和天然殺傷細胞產(chǎn)生的一種廣譜抗病毒糖蛋白。人干擾素-γ由于其具有抗病毒、抗腫瘤、控制細胞凋亡的活性，且對細胞來說有嚴格的選擇性，常被用于臨床研究及實踐中?，F(xiàn)有5種疾病被美國FDA批準可用IFN進行臨床治療，即毛細胞白血病、慢性肉芽腫病、與AIDS相關(guān)的卡波肉瘤、丙型肝炎和尖銳濕疣。正是由于IFN-γ的高度生物活性，其制備和應(yīng)用受到人們的廣泛關(guān)注與重視。隨著對干擾素生物活

2、性和臨床應(yīng)用的研究不斷深入以及DNA重組技術(shù)的應(yīng)用，使大規(guī)模生產(chǎn)干擾素成為現(xiàn)實，并為日益廣泛的臨床應(yīng)用提供了可能性。目前生產(chǎn)IFN-γ的方法主要是利用基因工程方法大量生產(chǎn)，其中以利用大腸桿菌生產(chǎn)IFN-γ最為常見。但是，由于大腸桿菌表達外源基因的過程中會遇到很多困難，致使表達效率不高而使所表達蛋白質(zhì)多為包涵體。其中，以干擾素類蛋白在大腸桿菌中以包涵體的形式表達最為常見。為獲得有活性的重組蛋白，需將包涵體進行洗滌、溶解以及不同濃度的尿素梯

3、度復(fù)性，過柱純化才能得到，生產(chǎn)周期和成本大大增加。為縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本，獲得分泌表達的可溶性重組人干擾素-γ顯得尤為重要。本文就重組可溶性人干擾素-γ工程菌的生產(chǎn)條件進行了優(yōu)化，并最終獲得了有生物活性的人干擾素-γ蛋白，為工業(yè)上低成本生產(chǎn)干擾素蛋白提供了理論及實驗基礎(chǔ)。具體實驗結(jié)果如下：
　　1、采用PCR技術(shù)從人外周血細胞cDNA文庫中擴增出長為501bp的人干擾素-γ(hIFN-γ)的基因片段，將之克隆至原核表達載體p

4、GEX-4T-1及SUMO中，構(gòu)建出重組載體pGEX-4T-1/hIFN-γ及SUMO/hIFN-γ。
　　2、以上重組載體克隆至E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)表達后，SDS-PAGE鑒定顯示在溫度為24℃、轉(zhuǎn)速為120rpm、IPTG為誘導(dǎo)劑且其最終濃度為0.2mM誘導(dǎo)8h時，以SUMO/hIFN-γ系統(tǒng)表達可溶性蛋白的量最高，其中可溶性hIFN-γ蛋白占總?cè)诤系鞍椎?0％左右。
　　3、通過對工程菌的培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)