高密度培養(yǎng)盤基網(wǎng)柄菌及重組可溶性人Fas配體表達(dá)的研究.pdf

1、盤基網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)，又稱為阿米巴蟲是一種簡(jiǎn)單的原生動(dòng)物。它的細(xì)胞個(gè)體(直徑5-10μm)大于微生物，生長(zhǎng)速率高于動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)基中不需要添加血清，更重要的是，它們具有類似于高等動(dòng)物的蛋白糖基化修飾能力。因此在作為宿主細(xì)胞表達(dá)復(fù)雜的重組藥用蛋白(特別是糖蛋白)方面，有廣闊的應(yīng)用前景，但也存在著細(xì)胞密度及蛋白質(zhì)表達(dá)水平低等問(wèn)題有待于解決。 本論文通過(guò)對(duì)搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的優(yōu)化提高了盤基網(wǎng)柄

2、菌培養(yǎng)密度，并建立了模擬細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型。進(jìn)行了盤基網(wǎng)柄菌固定化培養(yǎng)研究，研制了以聚氨酯泡沫、棉纖維織物為固定化載體的固定化生物反應(yīng)器。同時(shí)以可溶性人Fas配體(shFasL)作為示例蛋白，對(duì)重組表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了基因工程改造，考察了可溶性人Fas配體生產(chǎn)的工藝條件，并對(duì)其分離及純化工藝進(jìn)行了初步探索。 通過(guò)搖瓶培養(yǎng)條件的單兇素優(yōu)化，確定盤基網(wǎng)柄菌AX3-pLu8的最佳培養(yǎng)條件為：溫度22℃，pH6.5，搖床轉(zhuǎn)速150r

3、pm，培養(yǎng)時(shí)間100-120小時(shí)左右；培養(yǎng)基最佳碳源為葡萄糖，最佳葡萄糖濃度為15g/l。通過(guò)在HL-5C培養(yǎng)基中分別添加0.2gl-1色氨酸和0.4gl-1半胱氨酸顯著提高最高細(xì)胞密度。在上述優(yōu)化條件下，最高細(xì)胞密度達(dá)到了3.5×107ml-1。在此基礎(chǔ)上，在5L發(fā)酵罐上對(duì)分批發(fā)酵培養(yǎng)盤基網(wǎng)柄菌進(jìn)行了考察，確定最優(yōu)批次發(fā)酵條件為pH6.5，通氣量1vvm，根據(jù)菌體生長(zhǎng)情況分階段改變轉(zhuǎn)速，在最優(yōu)條件下，菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期被有效地延長(zhǎng)到了7

4、0小時(shí)，最高菌體密度達(dá)到3.7×107ml-1。對(duì)盤基網(wǎng)柄菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，建立了一個(gè)四參數(shù)邏輯方程生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，完整地模擬了盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞生長(zhǎng)直至死亡的全過(guò)程。 在搖瓶條件下，分別考察了利用聚氨酯泡沫以及棉纖維織物作為載體固定化盤基網(wǎng)柄菌的培養(yǎng)，在此研究的基礎(chǔ)上，研制了以聚氨酯泡沫為固定化載體的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器和以棉纖維織物為固定化載體的纖維床生物反應(yīng)器(旋轉(zhuǎn)式、外循環(huán)式)。在聚氨酯泡沫旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器中最高菌體密度

5、達(dá)到了4.2×107ml-1，在旋轉(zhuǎn)式纖維床生物反應(yīng)器中固定化細(xì)胞密度最高達(dá)到8.2×107mL-1，而在外循環(huán)式纖維床生物反應(yīng)器中固定化細(xì)胞密度進(jìn)一步提高到了1.37×108mL-1，遠(yuǎn)高于普通懸浮培養(yǎng)時(shí)1～2×107ml-1的平均細(xì)胞密度。 對(duì)原有的盤基網(wǎng)柄菌重組表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改造，構(gòu)建了帶有His-tag的重組pMB74-shFasL-H質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)入盤基網(wǎng)柄菌AX3宿主菌進(jìn)行表達(dá)，目的蛋白shFasL的表達(dá)量達(dá)到了157

6、.8μgl-1。而在外循環(huán)式纖維床反應(yīng)器固定化培養(yǎng)條件下，shFasL的農(nóng)達(dá)量可進(jìn)一步提高到173.7μgl-1，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的重復(fù)批次發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了在360小時(shí)中shFasL的持續(xù)表達(dá)，且發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞密度、蛋白產(chǎn)率均沒(méi)有明顯下降。對(duì)產(chǎn)物shFasL的分離純化進(jìn)行了初步研究，最終獲得的重組蛋白的純度可達(dá)到91.0％，回收率達(dá)到了92.1％。 此外，在攻讀博士學(xué)位期間，本人還參與了國(guó)家“863”計(jì)劃日標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目“微生物高效生產(chǎn)聚谷