膨脹素工程菌的構(gòu)建及表達(dá)條件的優(yōu)化.pdf

1、纖維素是地球上存儲(chǔ)量最豐富、分布最廣的有機(jī)物質(zhì)。同時(shí)它又是一種可再生物質(zhì)，它的降解可產(chǎn)生葡萄糖，這是生物界能量循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。但由于纖維素的高結(jié)晶構(gòu)造，其外圍又由木質(zhì)素層包圍著，這樣的結(jié)構(gòu)直接影響了纖維素的理化性質(zhì)，要把它水解成可利用的葡萄糖難度很大。膨脹素是一種能使細(xì)胞壁軟化、伸展的蛋白。通過多年來對(duì)膨脹素的研究發(fā)現(xiàn)，膨脹素并不能直接水解纖維素分子的糖苷鍵，而是對(duì)纖維素酶水解纖維素有協(xié)同作用，它能夠把纖維素鏈間的氫鍵打斷，有效地破壞了

2、纖維素的結(jié)構(gòu)，提高了纖維素酶對(duì)纖維素的水解效率。本研究以黃瓜D0462為基因供體，提取總RNA，克隆膨脹素基因Cs-EXPA1和Cs-EXPA2，分別構(gòu)建畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPHαM-EXPA1和pGAPHαM-EXPA2，轉(zhuǎn)入畢赤酵母中獲得工程菌，誘導(dǎo)膨脹素蛋白表達(dá)，對(duì)膨脹素蛋白的協(xié)同活性檢測條件和工程菌的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高膨脹素蛋白與纖維素酶協(xié)同降解纖維素的效率。
　　 本研究主要內(nèi)容及結(jié)果包括：⑴采用RT-PC

3、R的方法從黃瓜D0462中克隆了Cs-EXPA1基因和Cs-EXPA2基因，測序得到的基因序列與GeneBank上的序列基本一致。⑵成功構(gòu)建了組成型表達(dá)載體pGAPHαM-EXPA1和pGAPHαM-EXPA2。⑶表達(dá)載體pGAPHαM-EXPA1和pGAPHαM-EXPA2分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglⅡ線性化，通過電擊成功轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中。經(jīng)過菌落PCR和基因組PCR鑒定，結(jié)果表明外源基因成功整合到畢赤酵母染色體上。⑷鑒定正確的轉(zhuǎn)化子在Y

4、PD培養(yǎng)基上經(jīng)過搖床培養(yǎng)使蛋白表達(dá)，通過SDS-PAGE凝膠電泳在29kD處檢測到目標(biāo)蛋白。⑸通過不同膨脹素與纖維素酶協(xié)同作用的比較，EXPA1蛋白與纖維素酶的協(xié)同活性是17.7％，EXPA2蛋白與纖維素酶的協(xié)同活性是59.8％，EXPA1蛋白、EXPA2蛋白與纖維素酶的協(xié)同活性是30.8％。通過顯微鏡觀察濾紙崩解情況發(fā)現(xiàn)，經(jīng)有膨脹素蛋白上清處理后的濾紙邊緣有明顯崩解作用。⑹通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膨脹素蛋白與纖維素酶協(xié)同反應(yīng)36h時(shí)產(chǎn)生的還原糖