鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶原核基因工程菌的構(gòu)建與表達(dá)條件優(yōu)化.pdf

1、新橙皮苷在植物內(nèi)的含量較低，其同分異構(gòu)體橙皮苷在植物體內(nèi)含量較高。兩者的結(jié)構(gòu)上的差異僅僅是黃酮環(huán)上取代基上葡萄糖與鼠李糖的糖苷鍵不同。本研究希望利用生物轉(zhuǎn)化法將橙皮苷轉(zhuǎn)化為新橙皮苷。本文通過(guò)構(gòu)建一株原核工程菌來(lái)表達(dá)鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶可以催化鼠李糖與葡萄糖通過(guò)1,2糖苷鍵連接，以此來(lái)合成新橙皮苷，并且對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，還對(duì)工程菌的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。主要的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.原核工程菌的構(gòu)建及表達(dá)：從Lact

2、obacillus plantarum WCFS1的基因組中擴(kuò)增得到編碼鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的glycosyltransferase(rhamnosyltransferase),family2(GT2)基因，將該目的基因與表達(dá)載體pET-DsbA連接，得到重組表達(dá)載體pET-DsbA-GT2。將表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21(DE3)，成功構(gòu)建得到了原核表達(dá)工程菌BL21(pET-DsbA-GT2)；采用誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)工程菌BL21(pET-

3、DsbA-GT2)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，GT2與DsbA成功的融合表達(dá)，得到了56.7 kDa左右大小的融合蛋白（其中，GT2的大小為35.7 kDa，DsbA的大小為21 kDa）。表達(dá)方式為部分包涵體、部分可溶性表達(dá)。
　　2.鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究：通過(guò)分離純化分別得到了包涵體蛋白酶(GT2-1)、可溶性蛋白酶（GT2-2）兩種鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶。酶活測(cè)定結(jié)果顯示GT2-1的比活力為0.41 U/mg，遠(yuǎn)低于可溶性目

4、的蛋白GT2-2的1.92 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果：GT2-1、GT2-2兩種酶的最適反應(yīng)溫度38-40℃，最適pH值為6.0-6.5；GT2-1、GT2-2在20-40℃處理1 h后的酶活仍能達(dá)到90％以上，當(dāng)溫度超過(guò)40℃時(shí)，GT2-1的酶活隨著溫度的升高迅速降低，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)便完全失去酶活，GT2-2溫度達(dá)到80℃才完全失去酶活；GT2-1、GT2-2在pH值在5-10這個(gè)范圍內(nèi)均具有較好的穩(wěn)定性。
　　3.重組