柚檸檬苦素葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、表達及植物表達載體的構(gòu)建.pdf

1、檸檬苦素類似物是引起柑橘苦味的主要原因之一,柑橘的苦味對柑橘果實的鮮食和加工品質(zhì)有明顯不利影響。此外,檸檬苦素類似物具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、昆蟲拒食等很多藥理活性。由于檸檬苦素類似物具有這些功能,所以檸檬苦素類似物的需求日益增加,但是苦味的存在限制了人們對它的攝取。檸檬苦素類似物配糖體具有水溶性且無苦味等特性,其生物學活性和檸檬苦素類似物是相似的。因而將其作為替代性食品添加劑,有很好的市場前景。
　　 本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,

2、從梁平柚中擴增出了一個檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因CmLGT。先后構(gòu)建了CmLGT基因的原核表達載體和植物表達載體,研究的主要結(jié)果如下:1.檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因CmLGT的擴增及編碼蛋白性質(zhì)分析。
　　 根據(jù)GenBank公布的檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(LGT)基因的核苷酸序列,設(shè)計并合成特異性引物。以梁平柚成年樹幼葉總RNA為模板,通過PCR方法擴增到檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的全長編碼區(qū),并通過生物

3、信息學方法對CmLGT基因編碼蛋白的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特點進行了分析,結(jié)果顯示:它編碼511個氨基酸,分子量約為57.467KD,等電點為6.01,有21個磷酸化位點,沒有信號肽。CmLGT蛋白二級結(jié)構(gòu)由α螺旋(helix,28.18％),延伸鏈(extended strand,22.11％),隨機卷曲(random coil,49.71％)組成。在NCBI上對其保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)CmLGT基因編碼的蛋白具有GT家族的特征。
　　 2

4、.CmLGT基因原核表達載體的構(gòu)建及表達體系的優(yōu)化。
　　 將目的基因克隆到原核表達載體pET-28a(+)中,構(gòu)建了該基因的融合表達載體pET28a-CmLGT,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)最優(yōu)條件(4 h,37℃和1.0mmol·L-1IPTG)誘導表達獲得大小約為62kD的目的融合蛋白,對融合蛋白進行可溶性分析發(fā)現(xiàn)該融合蛋白以包涵體形式存在。
　　 3.植物表達載體的構(gòu)建。
　　 通過雙酶切、連

5、接、轉(zhuǎn)化等過程將目的基因CmLGT連接到植物表達載體pCAMBIA2301g中,轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404,利用BamHI和SacI雙酶切及PCR驗證,表明成功構(gòu)建了目的基因的植物表達載體并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。
　　 4.對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。
　　 應用農(nóng)桿菌介導的葉盤法將含有檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因CmLGT的植物表達載體導入野生煙草植株中,通過抗性篩選、GUS組織化學染色以及PCR擴增檢測,獲得轉(zhuǎn)基