α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株的選育及產(chǎn)酶條件的研究.pdf

1、環(huán)糊精（cyclodextrin，簡(jiǎn)稱為CD），是由一部分微生物的某些種所生產(chǎn)的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlycosyltransferase，簡(jiǎn)稱為CGTase，E.C.2.4.1.19)作用于糖類而產(chǎn)生的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱。它們的命名基于成環(huán)葡萄糖基的數(shù)量，以6個(gè)葡萄糖基單位組成的環(huán)糊精，稱為α-環(huán)糊精，以此類推，7個(gè)的是β-環(huán)糊精，8個(gè)的是γ-環(huán)糊精。CD分子是呈上寬下窄、兩端開(kāi)口、中空的筒狀物，外緣(R

2、im)親水而內(nèi)腔(Cavity)疏水，而所有羥基則在分子外部，其中，環(huán)糊精的伯羥基圍成了錐形的小口，而其仲羥基圍成了錐形的大口。這一特殊結(jié)構(gòu)，使CD能夠包絡(luò)不同的化合物，如與有機(jī)分子、稀有氣體、無(wú)機(jī)化合物等形成包合物，使它們理化性質(zhì)發(fā)生巨大變化，使其在手性分離、超分子化學(xué)、模擬酶、新材料和分子識(shí)別等領(lǐng)域有很高的研究應(yīng)用價(jià)值;在食品香精香料、分析檢測(cè)、農(nóng)業(yè)育種、化妝品保濕、化工、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域受到了極大的重視和廣泛用途。
　　 C

3、D的生產(chǎn)是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，到目前為止，CD的制備大都采用酶法。CGTase在一定條件下，通過(guò)催化、環(huán)化、耦合和歧化反應(yīng)作用于淀粉、糖原以及麥芽低聚糖生成CD。制備CD的原料包括玉米淀粉、木薯淀粉、馬鈴薯淀粉以及麥芽糊精等。能產(chǎn)生CGTase的微生物菌種有很多種，芽孢桿菌屬的多種細(xì)菌都能產(chǎn)生CGTase，如軟化芽孢桿菌(Bacillusmacemns)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillusci

4、rculans)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)嗜堿性芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)和產(chǎn)酸克氏桿菌(Klebsiellaoxytoca)等。大多數(shù)CGTase作用于淀粉或其水解物時(shí)都能轉(zhuǎn)化成α-CD、β-CD和γ-CD，但不同菌種來(lái)源的CGTase轉(zhuǎn)化底物得到的三種CD的比例也是不同的。
　　 α-環(huán)糊精葡萄糖

5、基轉(zhuǎn)移酶（α-CGTase）是α-CD生產(chǎn)過(guò)程中必不可少的一種酶，要提高α-CD的產(chǎn)量，篩選一株α-CGTase高產(chǎn)菌株就至關(guān)重要。本課題就是從富含淀粉的土樣中，根據(jù)α-環(huán)糊精包接甲基橙使培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化這一原理，初篩出22株產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株，然后比較透明圈法大小篩選出3株酶活力較高的菌株，最后繪制酶活力曲線，得到一株酶活力為0.64U/mL的菌株N1。通過(guò)菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色、顯微觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)菌株N1進(jìn)行

6、鑒定，結(jié)果為腸桿菌科的產(chǎn)酸克雷伯氏菌。
　　 為了進(jìn)一步提高α-CGTase的產(chǎn)酶水平，用紫外線(UV)、亞硝酸、硫酸二乙酯(DES)、及亞硝酸+硫酸二乙酯復(fù)合誘變方法對(duì)菌株N1進(jìn)行誘變處理，結(jié)合平板快速篩選方法，得到一株產(chǎn)α-CGTase較高的菌株D6。其酶活力為5.68U/mL，與出發(fā)菌株N1相比，提高了787％。連續(xù)傳代培養(yǎng)8次，并檢測(cè)酶活力，突變株D6酶活力基本穩(wěn)定。鑒于此確定D6為本課題所篩選到的α-CGTase高產(chǎn)菌