環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶分子改造、產(chǎn)物特異性及其酶學性質(zhì)研究.pdf

1、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)是一種多功能酶，可以催化多聚糖分子內(nèi)的轉(zhuǎn)糖基作用，即環(huán)化反應，也能參與偶合反應、水解反應、歧化反應等分子間的轉(zhuǎn)糖基作用。通過環(huán)化反應催化淀粉及相關基質(zhì)生成環(huán)糊精是其產(chǎn)業(yè)應用的基礎，最常見的是生產(chǎn)α-、β-、γ-環(huán)糊精。環(huán)糊精具有外部親水內(nèi)腔疏水的特點，能夠包含客體分子從而改變其物理化學性質(zhì)，如增加溶解性和穩(wěn)定性，在食品、化妝品、醫(yī)藥、環(huán)境保護等方面具有重要作用。而作為生產(chǎn)環(huán)糊精的關鍵酶，CGTase越來越

2、引起人們的重視。
　　目前已有的CGTase催化產(chǎn)物都是α-、β-、γ-環(huán)糊精的混合物，較差的產(chǎn)物特異性對單一環(huán)糊精的產(chǎn)率及后續(xù)純化分離造成不利影響。因此，借助基因工程手段對CGTase進行定點突變改善CGTase的產(chǎn)物特異性成為重要研究方向之一。針對上述問題，本文以前期構建的含有重組質(zhì)粒pET22b/cgt為基礎，對CGTase關鍵氨基酸序列進行飽和突變，分析氨基酸與CGTase產(chǎn)物特異性之間的內(nèi)在聯(lián)系，主要結果如下:
　

3、　通過多重序列對比及相關文獻分析，發(fā)現(xiàn)來源于蠟狀芽孢桿菌的CGTase43位氨基酸對CGTase產(chǎn)物特異性具有重要作用。實驗中以構建的重組質(zhì)粒pET22b/cgt為模板，采用全質(zhì)粒的突變方法對43位組氨酸進行飽和突變，將酶解過后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)進大腸桿菌DMT中，在含有100μg/mL的LB平板篩選得到陽性克隆菌株，成功構建突變株H43P、H43Q、H43L、H43I、H43F、H43K、H43A、H43C、H43Y、H43E、H43N、

4、H43R、H43S、H43T、 H43G、 H43M、 H43W;
　　以1CXK作為模板，采用同源建模的方式構建了來源于Bacillus cereus的CGTase的空間結構，并用分子動力學軟件對模建的結構進行優(yōu)化獲得了可靠的蛋白質(zhì)三維模型。通過與麥芽九糖抑制劑的分子對接，分析了底物結合凹槽處的相關情況，對-3亞位點及43位氨基酸做出分析;
　　通過定點突變技術將43位的組氨酸突變成苯丙氨酸(H43F)、酪氨酸(H43Y)

5、和色氨酸(H43W)后，CGTase酶活力從6570 U/mL提高到6667U/mL、7814U/mL、15609U/mL，說明含有芳香環(huán)的氨基酸有利于提升CGTase降解玉米淀粉的能力;大部分氨基酸代替CGTase43位的組氨酸后，β-CD在產(chǎn)物中所占比例減小，而γ-CD比例增加。用殘基側(cè)鏈短的氨基酸代替原有位置的組氨酸，如H43P、H43A、H43G突變酶的催化產(chǎn)物中γ-CD所占比率為30.2％、28.3％、28.1％，其中原始酶組

6、γ-CD占20％;用疏水性強的亮氨酸和異亮氨酸代替組氨酸后，H43I、H43L突變酶催化產(chǎn)物中γ-CD所占比率為28.4％和28.0％;另外H43T突變酶催化產(chǎn)物中γ-CD所占比率為29.2％;
　　對γ-CD特異性最好的H43P、H43I、H43T突變酶進行酶學性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)與原始酶性質(zhì)相似，突變酶的最適溫度為60℃，最適pH為9.0，pH在6.0到9.0區(qū)間內(nèi)保持穩(wěn)定，但是H43P、H43I突變酶的熱穩(wěn)定性比原始酶更好，80℃