嗜熱環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的分子改造.pdf

1、環(huán)糊精（Cyclodextrin, CD)因有獨特的內(nèi)疏水外親水結(jié)構(gòu)，能改變其它分子的物理化學(xué)性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。酶法合成是工業(yè)化生產(chǎn)環(huán)糊精的主要方法，即利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase, CGTase）的環(huán)化反應(yīng)將淀粉或相關(guān)基質(zhì)合成環(huán)糊精。本論文以來源于地芽胞桿菌CHB1環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為研究對象，通過分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行改造，提高其利用可溶性淀

2、粉等底物生成環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率、可溶性表達(dá)、產(chǎn)物特異性。主要研究工作如下：
　?。?）通過易錯PCR技術(shù)向CGTase基因cgt中引入隨機(jī)突變，建立突變文庫，利用96孔板篩選系統(tǒng)得到胞外酶活和可溶性表達(dá)提高的突變體ds-6和ep-9，其胞外α-環(huán)化活力分別是原始酶的1.72倍和2.18倍，可溶性表達(dá)量提高了1倍。序列分析表明，突變體ep-9有三個堿基發(fā)生了變化：g2005a/a2037g/t2081g，有兩個氨基酸發(fā)生改變。酶學(xué)性質(zhì)表

3、明：突變體ep-9的β-環(huán)化比活力是原始酶的2.44倍，總環(huán)化比活力提高了34％，Km值由4.3 g/L降低到3.74 g/L；在pH穩(wěn)定性方面較原始酶有所提高。單堿基定點突變證實突變體ep-9可溶性表達(dá)水平及胞外酶活性提高的關(guān)鍵突變是g2005a。研究結(jié)果表明g2005a突變對于提高CGTase的可溶性表達(dá)及胞外酶活起關(guān)鍵作用，這對認(rèn)識CGTase的構(gòu)效關(guān)系以及進(jìn)一步改造該酶分子、擴(kuò)大酶的生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。
　　（2）為了研

4、究來源于地芽胞桿菌CHB1的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）的催化效率和產(chǎn)物特異性的作用機(jī)理，對其氨基酸序列和模擬結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，確定其淀粉結(jié)合位點2處第623位氨基酸殘基可能影響其催化效率。運用重疊PCR技術(shù)，在其淀粉結(jié)合位點2處第623位進(jìn)行定點飽和突變，構(gòu)建19種不同氨基酸殘基突變體。將突變基因與pET-28a(+)-ompA載體連接并在大腸桿菌BL21(DE3）中表達(dá)。以可溶性淀粉為底物，HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物中的環(huán)糊精含量變

5、化。結(jié)果表明，相對于野生型CGTase，突變酶N623T的催化效率明顯提高，總環(huán)化活力提高了58.6%，α-環(huán)化活力提高了64%，β-環(huán)化活力提高了80.5%，而γ-環(huán)化活力降低了35.3%。產(chǎn)物特異性方面，相比野生型CGTase，突變酶N623T的淀粉總轉(zhuǎn)化率從11.3%提高至39.7%，提高了251.3%，其中α-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精所占比例縮減為32.8%和7.7%，β-環(huán)糊精提高至59.5%。分析其可能機(jī)理為：與野生型CGTase

6、相比，突變體N623T中蘇氨基酸殘基代替了天冬酰胺，造成淀粉結(jié)合位點2處的構(gòu)象發(fā)生了變化，該構(gòu)象優(yōu)化了底物作用方向，有利于反應(yīng)的進(jìn)行，從而提高了酶的催化效率。
　?。?）以融合酶與底物麥芽六糖的結(jié)合自由能為指導(dǎo)從CBM20家族中選出一種CBM，利用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建了融合酶CGT△E-CBMbc251基因并將其插入pET-28a(+)-OmpA載體中實現(xiàn)異源表達(dá)。以可溶性淀粉為底物時，融合酶的三種環(huán)化活力有不同程度的提高，α-，β

7、-，γ-環(huán)化活力分別40.2%、24.3%和181.58%。對酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果表明兩種酶的最適反應(yīng)溫度都是60℃，融合酶的最適反應(yīng)pH比原始酶增加了1，為pH6.0。以可溶性淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉為底物測兩種酶的反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明融合酶的米氏常數(shù)Km都有所降低，對底物的親和力增加了，催化效率Kcat/Km分別提高了1.31、0.17和3.72倍。通過對融合酶和原始酶CGT△E-CBMbc251模擬結(jié)構(gòu)與底物麥芽六糖的分子對接

8、分析，結(jié)果表明與原始酶相比，融合酶與底物的分子對接自由能明顯比較低，說明融合酶與底物結(jié)合能力比原始酶要強(qiáng)，反應(yīng)更易進(jìn)行。三維結(jié)構(gòu)圖顯示，兩者的區(qū)別在于淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生了變化。
　?。?）通過優(yōu)化表達(dá)條件，提高環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的可溶性表達(dá)和胞外酶活性。本研究構(gòu)建了含 cgt基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-ompA-cgt，篩選最適誘導(dǎo)溫度，并構(gòu)建5種分子伴侶共表達(dá)系統(tǒng)(pKJE8、pKJE7、pG

9、ro7、pTf16和pG-Tf2，5種分子伴侶質(zhì)粒分別與重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-ompA-cgt共表達(dá))，篩選最適分子伴侶質(zhì)粒，優(yōu)化共表達(dá)條件。結(jié)果表明通過SDS-PAGE分析和測定胞外酶活，CGTase在大腸桿菌中成功實現(xiàn)表達(dá)，且具有一定量的重組CGTase分泌至胞外；25 ℃誘導(dǎo)時CGTase的可溶性表達(dá)和在胞外上清中的酶活都最高；分子伴侶質(zhì)粒pKJE8使酶的胞外活性提高了48.6%，效果最為顯著；當(dāng)L-阿拉伯糖濃度為0.