培養(yǎng)基添加劑對重組大腸桿菌胞外生產重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的影響.pdf

1、環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱CGT酶，EC2.4.1.19)是一種能夠通過分子內轉糖基化反應轉化淀粉及相關基質合成環(huán)糊精的胞外酶。隨著環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥等領域的應用越來越廣，CGT酶已經成為當今研究的熱點。為了克服天然菌株的低CGT酶生產能力，CGT酶基因在大腸桿菌(Escherichia coli)中過量表達被認為是最有效途徑之一。然而，以前的報道表明，CGT酶在E.coli中表達通常形成不溶性包涵體或定位于周質空間，限制了其工業(yè)應用，

2、因此，實現CGT酶的胞外表達是迫切需要的。本文以實驗室構建的含表達載體cgt/pET20b(+)的E.coli BL21(DE3)為生產菌株，以實現重組α-CGT酶的高產量及高生產強度為目標，對在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量添加劑對胞外基質中的產酶情況進行了較為系統的研究，并進一步對其機理進行了剖析。主要研究結果如下：
　　 (1)在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，考察了表面活性劑的添加對重組E.coli胞外生產α-CGT酶的影響。研究結果表明，在發(fā)酵

3、培養(yǎng)基中添加表面活性劑對重組E.coli的生長都有一定的抑制，而且添加濃度越大，抑制作用越強。其中CTAB對菌體生長的抑制作用最大；Tween-80對菌體生長的抑制作用最小。表面活性劑的添加對重組E.coli胞外生產α-CGT酶有促進作用，其中在發(fā)酵20 h添加0.02% SDS效果最好，發(fā)酵40 h胞外α-CGT酶酶活達5.31 U/mL，比對照組提高了5.25倍。
　　 (2)在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，考察了金屬離子的添加對重組E

4、coli包外生產α-CGT酶的影響。研究結果表明，只有在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Ca2+才對重組E.coli胞外生產α-CGT酶有促進作用，當其添加濃度為2.5 mM時，胞外α-CGT酶酶活達1.12 U/mL，是對照組的1.3倍。Ca2+對胞外酶活的提高除了與細胞膜透性有關，還可能與其對細胞生長的輕微促進作用有一定的關系。
　　 (3)在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，考察滲透壓調節(jié)劑的添加對重組E.coli胞外生產α-CGT酶的影響。研究結果表明，

5、蔗糖和山梨醇對菌體的生長有較好的促進作用，其他添加劑對菌體的生長都有不同程度的抑制作用。而只有添加L-脯氨酸和鈉離子對胞外生產α-CGT酶有促進作用，當脯氨酸和鈉離子的添加濃度分別為75 mM和500 mM時，胞外酶活分別是對照組的2.02倍和4.2倍。
　　 (4)以SDS、Na+、甘氨酸和Ca2+為四個因素，以實現α-CGT的高產量為目標設計Lg(34)正交實驗，正交優(yōu)化實驗結果表明，影響產酶的各種因素的主次因子順序為甘氨酸

6、> SDS>Na+> Ca2+。大腸桿菌胞外生產α-CGT酶的最佳工藝條件為添加0.03% SDS，400 mM Na+，0.3%甘氨酸和10 mM Ca2+。發(fā)酵條件優(yōu)化后得到的酶產量比優(yōu)化前的酶產量提高了15倍左右，達到12.89 U/mL。
　　 (5)分別以ONPG和NPN熒光探針觀察重組E.coli細胞內膜和外膜滲透性的變化，結果顯示，在發(fā)酵最佳工藝條件下培養(yǎng)的重組E.coli細胞內外膜相對于對照組有更高的的滲透性，使

7、得重組α-CGT酶更容易釋放到胞外。
　　 (6)對重組E.coli細胞膜磷脂含量的分析表明:在發(fā)酵最優(yōu)工藝條件下培養(yǎng)的重組E.coli細胞膜中磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)含量分別為20.3%和71%，而在不含任何添加劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的重組E.coli細胞膜中PG和PE含量分別18.2%和75.8%。PG含量的增加，可能促進了分泌伴侶蛋白SecA與膜的結合，同時促進了前體目標蛋白的跨膜運出，從而提高了胞外重組α-CG

8、T酶的產量。
　　 (7)對重組E.coli細胞膜磷脂含量的分析表明：在發(fā)酵最優(yōu)工藝條件下培養(yǎng)的重組E.coli，其細胞膜中C16:1、C18:1和C19:1酸的百分含量都有所提高，分別從對照的1.3%、13.41%和2.28%提高到2.34%、20.85%和23.27%，C14:1酸的百分含量從對照的0.29%降低到0.11%。培養(yǎng)基添加劑的添加還促使膜脂中C17:0酸的百分含量從27.45%降低到26.11%。培養(yǎng)基添加劑可