家蠶N-酰胺基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA的克隆與表達(dá)特征分析.pdf

1、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GlcNAcases)是一組主要催化N-糖鏈生成的酶類,主要分布在生物細(xì)胞中的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。能夠?qū)Ω黝愄穷愐约胺翘穷惖却蠓肿舆M(jìn)行修飾加工，從而實(shí)現(xiàn)其各類分子的生物學(xué)功能。昆蟲的 GlcNAcases在多種生理生化過程中都起非常重要的作用，包括對(duì)外源性和內(nèi)源性細(xì)胞底物進(jìn)行合成、分解、加工和修飾等許多方面。本研究對(duì)家蠶的GlcNAcases的cDNA進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)以及組織表達(dá)等分析。主要研究結(jié)果如下：
　　

2、1、根據(jù)家蠶基因組及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的GlcNAcases序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物，克隆獲得了目的基因。序列分析表明該基因ORF包含1113個(gè)堿基，編碼370個(gè)氨基酸，具有GlcNAcase催化功能的結(jié)構(gòu)域包含45個(gè)氨基酸序列，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族。構(gòu)建該基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，所克隆的家蠶的目的基因序列與鞘翅目昆蟲GlcNAcases同源性最高，命名為BmGlcNAcaseA。
　　2、將目的基因產(chǎn)物連接到質(zhì)粒 pET-28A（+

3、）表達(dá)載體上，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28A-BmGlcNAcaseA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DE3。優(yōu)化表達(dá)條件誘導(dǎo)其在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。經(jīng)過SDS-PAGE和Western Blot分析，結(jié)果表明，目的蛋白得到成功表達(dá)。利用NI-NTA親和層析柱對(duì)獲得的重組蛋白進(jìn)行蛋白純化并制備多克隆抗體，獲得的抗體效價(jià)為11400。
　　3、經(jīng)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)表明BmGlcNAcaseA在家蠶組織水平的表達(dá)存在差異。B

4、mGlcNAcaseA在卵巢和表皮表達(dá)量最高，其次是在中腸和脂肪體，血液、精巢和馬氏管表達(dá)最少。BmGlcNAcaseA家蠶表皮生長(zhǎng)期間表達(dá)量顯著上升，家蠶BmGlcNAcaseA基因可能與家蠶的表皮生長(zhǎng)有關(guān)。
　　4、家蠶5齡幼蟲經(jīng)核型多角體病毒、藤黃微球菌、白僵菌以及大腸桿菌的處理后，BmGlcNAcaseA基因表達(dá)量總體呈現(xiàn)先下降后上升的規(guī)律。BmGlcNAcaseA對(duì)病毒的反應(yīng)較敏感，而對(duì)其他三種菌的應(yīng)答比較慢。經(jīng)核型多角