β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的雙重誘變育種

1、2010NO4154SerialNo217ChinaBrewingExperienceExchangesB一環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的雙重誘變育種何飛燕，廖威，莫于旺，林華(廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品技術(shù)系，廣西南寧530226)摘要：建立以酚酞作指示劑，在瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基上篩選環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)突變株的平板快速篩選法，從土壤分離物中篩選到l株葡萄糖摹轉(zhuǎn)移酶(CGTase)產(chǎn)生菌gxmfl，于37℃、250r／mm搖床發(fā)酵3d。產(chǎn)酶1524

2、U／mL。該菌株經(jīng)紫外線和LiCI誘變處理后，篩選得到突變株B15，產(chǎn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶達(dá)5416U／mL，較出發(fā)菌株提高255％。連續(xù)5代傳代試驗表明突變株B15產(chǎn)酶基本穩(wěn)定。關(guān)鍵詞：育種；環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；雙重誘變中圖分類號：Q93331文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：0254—5071(2010)04—0154—D4DoublemutationbreedingofslrainproducingBcyclodextringlycosyltra

3、nsferaseHEFeiyanLIAOWei，MOYuwangLINHua(DepartmentofFoodTechnologyGuangxiVocationalandTechnicalCollegeNanning530226c1婦a)Abstract：Themethodoffastscreeninghighproductionof13cyclodcxtringlycosyltransferasestrainonagarsolidme

4、diumcontainingsolublestarchWasestablishedusingthephenolphthaleinasallindicatorAstraingxmflselectedfromsoilWasfoundtoproduce1524U／mlcyclodextringlyeosyl—transfera跎(CGTase)after3dfermentationat37℃under250r／minAmutantBl5was

5、obtainedbydoublemutationofultravioletradiationandLiCIsulfateTheactivityofthestrainWasenhancedby255％(5416u／rid)TheproductionofcyclodextringlycosyltmnsferasobYmutantB15Wasstableafter5generationscultureKeywords：breeding；cyc

6、lodextringlycosyl們nsferase；doublemutation環(huán)狀糊精(Cyclomaltodextrin，CD)是由D吡喃葡萄糖基以Ct一1。4葡萄糖苷鍵連接而成的環(huán)形低聚糖，因環(huán)連的葡萄糖基數(shù)的不同而分為僅、B一、Y一環(huán)糊精(葡萄糖基數(shù)分別為6、7、8個)It21。環(huán)狀糊精及其衍生物作為添加劑或包埋材料在食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥及環(huán)保領(lǐng)域用途廣泛且無毒副作用、包埋用量大等∞。環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(CyclodextrinG

7、lycosylTransferase，簡稱CGTase)是一種具有催化功能的多糖類合成收稿日期：200091203基金項目：廣西科技廳基金項目(桂科f10833163)作者簡介：何飛燕(1976)，女，講師，研究方向為微生物在食品加工中的應(yīng)用。長時間儲藏，到120d左右，2一酒樣沉淀數(shù)量多于3。酒樣；礦酒樣儲藏60d以上就會有沉淀產(chǎn)生，隨著更長時間儲藏，會產(chǎn)生大量沉淀；5”酒樣至少可以保持澄清104d，且在120d之內(nèi)，沉淀數(shù)量不會隨時

8、間變化增多；6。樣儲藏96d以上會有沉淀產(chǎn)生，繼續(xù)儲藏，隨著時間變化，渾濁程度逐漸加深，有沉淀生成；74酒樣經(jīng)過120d的靜置觀察，無渾濁現(xiàn)象產(chǎn)生，酒色呈玫瑰紅色，透亮，無失光現(xiàn)象。5結(jié)論通過在常溫條件下120d的觀察，可以得到的結(jié)論：(1)經(jīng)過不同實驗方法處理的7個玫瑰紅顏酒酒樣穩(wěn)定性的強弱差異：1明膠澄清法膨潤土過濾法低溫過濾法熱處理去除沉淀法檸檬酸放破敗法。(3)通過此次試驗，確定冷凍結(jié)晶法為玫瑰紅顏酒生產(chǎn)中去除沉淀的最有效生產(chǎn)工

9、藝，也成為玫瑰紅顏酒生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵控制點。(4)通過試驗研究得知，玫瑰紅顏酒出現(xiàn)酒體失光和沉底主要是由于在制作玫瑰浸漬液時添加了部分葡萄酒，葡萄酒中的酒石酸和玫瑰發(fā)酵液中光敏和熱敏性物質(zhì)結(jié)合形成了酒石酸氫鉀混合沉淀物。參考文獻(xiàn)：【I】無錫輕工大學(xué)微牛物學(xué)[M1北京：中國輕工業(yè)出版社，1997【2】張迅捷食物密碼口川北京：中國紡織出版社，2005【3】徐潔聽談葡萄酒沉淀與質(zhì)量【J】釀酒科技，2001(1)：103—106【4】黃舜榮葡萄

10、酒沉淀種類及其處理方法【J】食品與機械，2001(3)：262Z【5】彭濤玫瑰紅顏酒的研制【J】中國釀造，2008(24)：120122【6】王華，李華，郭安鵲二氧化硫在紅葡萄酒中的抗氧化性研究【J】中國食品添加劑，2003(5)：23【7】李勝元抗壞血酸對玫瑰香干白葡萄酒的抗氧化作用【刀釀造科技，2006(6)：144146【8】張新杰，王記俠，任玉華，等葡萄酒渾濁與沉淀的原因及其預(yù)防【J】中外葡萄與葡萄酒，2003(1)：5255【

11、9】趙玉玲，王運華葡萄酒中鈣穩(wěn)定性的工藝探討田中外葡萄與葡萄酒，200l(4)：4748【10】黃舜榮葡萄酒沉淀種類及其處理方隨J】食品與機械，20010)：2627【IlJ熊宏寰釀酒明膠和紅葡萄酒的澄清明葡萄栽培與釀酒，1998(4)：42_43【12】王照科葡萄酒酒石穩(wěn)定性試驗唧中外葡萄與葡萄酒，2007(1)：6263【13】韓志松，浦旭光淺議葡萄酒冷處理陰釀酒科技，1997(5)：6061萬方數(shù)據(jù)2010No4156Serial

12、No217ChinaBrewingExperienceExchanges試驗，測定酶活，結(jié)果(表1)表明，菌落gxmfl酶最高作為誘變出發(fā)菌株。表1原始菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力Table1Activityofcyclodextringlycosyitransferaseproducedbythewildstrains22Uv誘變結(jié)果221致死率統(tǒng)計菌懸液經(jīng)UV誘變后，做梯度稀釋涂平板，與37℃培養(yǎng)3d，統(tǒng)計菌落數(shù)。以致死率為縱坐標(biāo)，誘變時間為橫

13、坐標(biāo)，繪制致死曲線見圖1。從圖l可見，隨著誘變時間的增加，致死率逐漸升高，達(dá)到100s時，致死率為100％，根據(jù)經(jīng)驗，誘變時間為50p70s較好。蓮靜鬟籟誘變時|日J(rèn)／s圖1UV誘變致死曲線Figure1CuweofUVmortalityrate222平板初篩結(jié)果Uv誘變篩選，平板初篩挑選菌株，統(tǒng)計記錄見表2。UV誘變初篩共挑選菌株40株。初篩結(jié)果有8株Hc值比出發(fā)菌株提高8％以上，計為正突變。從結(jié)果來看，正突變率為20％。223搖瓶發(fā)

14、酵結(jié)果將平板篩選得到的8株Hc值正突變株分別接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，370C、250r／min搖床培養(yǎng)3d，測酶活力，最后得到4株酶活比較高的突變株。UV誘變搖瓶復(fù)篩得到產(chǎn)酶率最高的是菌株A29號，產(chǎn)酶率達(dá)到2837U／mL，與出發(fā)菌株gxmfl相比，酶活力提高86％。23LiCI誘變結(jié)果231致死率統(tǒng)計A29的孢子液經(jīng)LiCI誘變后，做梯度稀釋涂平板，于37％恒溫箱培養(yǎng)3d，統(tǒng)計菌落數(shù)。從統(tǒng)計結(jié)果來看，誘變劑用量O4％的致死率比較高，

15、劑量08％則致死率達(dá)到100％，以誘變劑量為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，繪制致死率曲線見圖2。從致死率曲線可見，隨著誘變劑量的增大，致死率逐漸升高。根據(jù)經(jīng)驗，誘變劑量選擇在04％4)5％比較合適。表2UV誘變平板初篩結(jié)果Table2SizeofthecolorlesszoneofmutantsbyUV菌號囂要菌落cm捌Hc值菌號婺墨菌落cm直御Hc值A(chǔ)1O90O60150A21105054195A2O89O57156A22O93049189

16、A3124O622OOA23089050177A4106O55193A24135O63214A5O7705l150A25O96054178A6098052189A26250O56160A7O90O55164A27108064170A8109047233A28109058189A9O70O50140A2913105l257AlOO95O57167A30124054229A1lO99O53188A3l11405421lA1204804810

17、0A32106061174A13O86057150A33115059195A14O88064138A3411lO53210A1509405517lA35062057109A16O72O48150A3609605019lA17O9lO52175A37122O55222A18107O57188A38110O6l18lA19O93O53175A39126053238A20O99O53188A40090054167表3UV誘變菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力T