牛α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除的研究.pdf

1、基因打靶是80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù).簡(jiǎn)而言之,它是指外源DNA與受體細(xì)胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生重組,并整合在預(yù)定位點(diǎn),改變細(xì)胞遺傳特性的方法.我們常見的為胚胎干細(xì)胞基因打靶.鑒于基因打靶在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的諸多優(yōu)點(diǎn),人們不斷探索該項(xiàng)技術(shù),并先后在鼠、豬和羊的體細(xì)胞中成功應(yīng)用.該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩種無(wú)啟動(dòng)子打靶載體來(lái)敲除牛α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因,以期獲得α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除的牛,并為乳腺生物反應(yīng)器的研究

2、提供更為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.利用La-PCR的方法,從牛的基因組中成功地得到了約為2.4kb、5.2kb、15.0kb的是三段擴(kuò)增產(chǎn)物.其中2.4kb片段位于5-7外顯子之間,包括了完整的第五及第六內(nèi)含子;5.2kb片段位于8-9外顯子,包括了完整的第八內(nèi)含子.15.0kb片段位于3-4外顯子,包括了完整的第三內(nèi)含子.測(cè)序結(jié)果表明所克隆的三個(gè)片段均為牛α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的基因組DNA片段.選取其中2.4kb、5.2kb的兩個(gè)片段分

3、別為左、右同源臂、以pCR-XL-TOPO為骨架載體,構(gòu)建無(wú)啟動(dòng)子打靶載體TOPO-IRESneo7.6;選取15.0kb、2.4kb兩片段為左、右同源臂、以pGEM-7zf為骨架載體,構(gòu)建了另外一種全新的無(wú)啟動(dòng)子打靶載體pGEM-7zfneo17.4.從妊娠兩月的黃牛胎兒分離成纖維細(xì)胞,Sry-PCR法性別鑒定為雄性,經(jīng)體外培養(yǎng)建立了一個(gè)性別已知的牛胎兒成纖維細(xì)胞系.以pEGFP-C1質(zhì)粒為外源DNA,在不同電擊參數(shù)設(shè)置下電擊轉(zhuǎn)染牛胎

4、兒成纖維細(xì)胞,在倒置熒光顯微鏡下觀察外源基因的轉(zhuǎn)染效率,發(fā)現(xiàn)在1kv/cm;3ms;1pulse的電擊參數(shù)設(shè)置下外源基因的轉(zhuǎn)染效率最高.因而在隨后的基因敲除實(shí)驗(yàn)中使用該套參數(shù)設(shè)置.純化的打靶載體TOPO-IRESneo7.6、pGEM-7zfneo17.4分別用Sfi I、Pvu I線性化后,電擊轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞,用G418(600μg/ml)篩選,先后共得到44個(gè)抗藥性細(xì)胞克隆,其中僅有1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8

5、號(hào)、9號(hào)細(xì)胞克隆能夠繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng),其余先后衰老死亡(其中1,2號(hào)克隆為成年黑白花奶牛成纖維細(xì)胞).擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞克隆分別提取其基因組DNA,經(jīng)PCR、Southern檢測(cè)后,初步證明2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)克隆的α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的其中一條等位基因與無(wú)啟動(dòng)子打靶載體pGEM-7zfneo17.4發(fā)生了同源重組.用EcoR I從質(zhì)粒pLPC-hTERT上切下人端粒酶基因(hTERT),科隆于質(zhì)粒pIRESneo的EcoR I位點(diǎn)構(gòu)建了重