分泌表達(dá)葡萄白藜蘆醇合成酶工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種植物抗毒素（phytoalexin），屬非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于多種植物中，其中中藥虎杖和葡萄中的含量尤為豐富。近年來對(duì)白藜蘆醇生理活性的研究表明：白藜蘆醇對(duì)于人的身體健康具有很多的藥理活性和保健功能，如抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗菌、免疫護(hù)肝、治療心血管疾病、保護(hù)線粒體、保護(hù)神經(jīng)作用等。目前，白藜蘆醇的制取方法主要是天然植物提取法、植物細(xì)胞培養(yǎng)法和化學(xué)合成法，但他們都有各自的缺點(diǎn)，因此

2、，利用基因工程的方法構(gòu)建能夠生產(chǎn)白藜蘆醇的工程菌是提高植物中Res含量的可行途徑之一。
　　本研究首先通過NCBI查詢到葡萄中白藜蘆醇合成酶基因的編碼序列（ID:AB046375），并根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以葡萄cDNA作為模板，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)特異性擴(kuò)增出白藜蘆醇合成酶基因，該基因序列大小為1179bp。將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET22b上，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)DH5a中，獲得克隆菌株DH5a-pET2

3、2b-RS，測(cè)序驗(yàn)證并保藏菌株。將質(zhì)粒pET22b-RS轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，獲得工程菌BL21-pET22b-RS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)到42.9KDa重組蛋白，與報(bào)道相同。
　　接著對(duì)可用于發(fā)酵生產(chǎn)白藜蘆醇的BL21-pET22b-RS重組菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。通過HPLC（高效液相色譜）檢測(cè)白藜蘆醇的方法，檢測(cè)添加底物對(duì)香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后得到的白藜蘆醇產(chǎn)量，并通過

4、對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化研究了一些重要因素對(duì)發(fā)酵的影響，確定了較為適合的白藜蘆醇生產(chǎn)條件。結(jié)果表明：當(dāng)種齡為12h，接種量為5％，誘導(dǎo)劑的濃度為0.1mM，培養(yǎng)溫度為30℃，pH為6.5，選用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，且甘油作為碳源，整個(gè)發(fā)酵過程的時(shí)間為24h，獲得白藜蘆醇的產(chǎn)量最高，可達(dá)25.21mg/L。
　　本研究成功的構(gòu)建了帶有白藜蘆醇合成酶基因的工程菌BL21-pET22b-RS，并且優(yōu)化了其發(fā)酵條件，為未來實(shí)現(xiàn)利用微生物生產(chǎn)白