生殖支原體MgPa重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫活性研究.pdf

1、目的:構(gòu)建生殖支原體(Mycoplasma genitalium,Mg)黏附蛋白MgPa的優(yōu)勢(shì)表位(1075~1364aa)基因(MgPa')的重組表達(dá)體,在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行免疫原性和免疫反應(yīng)性分析,為探索MgPa重組蛋白在Mg血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值和其生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:通過生物信息學(xué)分析,篩選并挑選MgPa基因優(yōu)勢(shì)抗原表位,以Mg G-37標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板,高保真聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)

2、增目的片段,將其亞克隆到原核表達(dá)載體pET-30a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a(+)/MgPa',然后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coliRosettaTM2(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用SDS-PAGE和Western-Blot進(jìn)行分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物;用Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,BCA法測(cè)定純化蛋白濃度。用純化的MgPa重組蛋白(rMgPa')免疫新西蘭兔,間接ELISA方法檢測(cè)免疫兔血清中MgPa'多克隆抗體的效價(jià),對(duì)rM

3、gPa'的免疫原性進(jìn)行分析。同時(shí)用純化的rMgPa'包被微孔板,建立間接ELISA方法,檢測(cè)Mg感染者陽(yáng)性血清及對(duì)照血清,根據(jù)重組蛋白與Mg陰、陽(yáng)性血清的反應(yīng)情況,對(duì)rMgPa'的免疫反應(yīng)性作出評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:Expasy軟件分析MgPa基因的抗原表位選擇了MgPa'基因的3223~4092bp位堿基序列為目的基因(MgPa',片段長(zhǎng)度為870bp,編碼290個(gè)aa);PCR擴(kuò)增得到大小約為870bp的目的片段;構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)

4、酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明其中插入片段為MgPa'目的基因,測(cè)序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致;SDS-PAGE分析顯示,在IPTG誘導(dǎo)下,重組工程菌表達(dá)了一相對(duì)分子量(Mr)約為37 KDa的目的蛋白條帶,目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以可溶性蛋白形式存在;經(jīng)Ni-NTA親和純化獲得了較高純度的重組蛋白;利用純化的rMgPa'免疫新西蘭兔,間接 ELISA法測(cè)定兔免疫血清特異性抗體效價(jià)在1﹕1280以上;Western-blot檢測(cè)rM

5、gPa'能與Mg免疫新西蘭兔抗血清發(fā)生特異性反應(yīng);以純化的rMgPa'為包被抗原建立間接ELISA法,對(duì)Mg感染者的陽(yáng)性血清及對(duì)照血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示重組蛋白能和Mg感染者陽(yáng)性血清特異性反應(yīng),表明重組蛋白有良好的免疫反應(yīng)性。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了pET-30a(+)/MgPa'原核表達(dá)體,將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后表達(dá)出了一相對(duì)分子量(Mr)約37KDa的重組蛋白;
　　2、rMgPa'具有較好的免疫原性,能刺激