牛支原體HB0801抗原蛋白的克能,表達(dá)和純化.pdf

1、支原體屬于柔膜體綱支原體屬，個(gè)體微小且基因組也相對(duì)小。支原體無(wú)細(xì)胞壁，但它有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)胞膜。為獲得其生存必的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，支原體與宿主細(xì)胞的形成了緊密的聯(lián)系。另外，支原體的宿主廣泛包括哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、節(jié)肢動(dòng)物和植物。在哺乳動(dòng)物中，它們通常定植呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道、乳腺和眼睛的粘膜表面。牛支原體是已知的對(duì)牛最重要的病原之一，它是導(dǎo)致奶牛乳房炎和育肥牛肺炎和關(guān)節(jié)炎的重要病原，也是導(dǎo)致?tīng)倥７窝缀完P(guān)節(jié)炎的重要的原因。盡管DNA重組技術(shù)

2、能使支原體 DNA在大腸桿菌中克隆和表達(dá)，但很難將整個(gè)蛋白在其中一起表達(dá)。事實(shí)上，大部分的支原體用大腸桿菌的終止子 UGA編碼色氨酸，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于已知菌株 HB0801的全基因組序列，我們通過(guò)定點(diǎn)突變的方法將每個(gè)基因中的UGA都變?yōu)閁GG，使牛支原體基因能在大腸桿菌中完整表達(dá)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室的蛋白質(zhì)組學(xué)操作工具（2-DE.MS），我們?cè)诙玖χ?HB0801中鑒定出了16個(gè)抗原蛋白。
　　本研究的目的是克隆、表達(dá)和純化已經(jīng)鑒定的

3、重要的免疫原性蛋白。本實(shí)驗(yàn)選取了5個(gè)抗原蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)。為了使色氨酸能成功在大腸桿菌中翻譯，先通過(guò)重疊延伸 PCR的方法定點(diǎn)將UGA突變?yōu)閁GG。在這5個(gè)基因中，編碼假想蛋白的Mbov_0739含有6個(gè)UGA位點(diǎn)，編碼轉(zhuǎn)酮酶基因（Mbov_0212）二氫硫辛酰、胺脫氫酶（Mbov_0106）和脂蛋白（Mbov_0579）都含有4個(gè) UGA位點(diǎn)，編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶 Mbov_0312含有3個(gè)UGA位點(diǎn)，通過(guò)定點(diǎn)突變，使它