牛支原體病學的免疫分析.pdf

1、牛支原體是一種在世界范圍內(nèi)廣泛存在的重要病原，主要引起肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎等，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。然而，由于牛支原體蛋白抗原特征不明確，使免疫學方法控制牛支原體病存在著巨大的困難。本論文通過免疫蛋白組學、免疫信息學、基因表達和免疫學方法對牛支原體的抗原特征進行了全面評估。從中國臨床分離株 HB0801提取全菌蛋白及用 TX-114提取膜蛋白進行雙向電泳，利用牛支原體臨床感染犢牛的陽性血清與蛋白反應后，通過 MALDI-TOF M

2、S質(zhì)譜技術(shù)進行了分析，共鑒定了39個抗原蛋白，其中32個為新發(fā)現(xiàn)的抗原蛋白。其中8個有反應原性的蛋白通過進一步的免疫信息學預測具有很高的免疫原性，分別由基因 Mbov_0106，0116，0126，0212，0275，0579，0739和0789編碼。通過重疊延伸 RCR定點突變技術(shù)將牛支原體中編碼色氨酸的密碼子UGA突變?yōu)樵诖竽c桿菌中表達色氨酸的密碼子 UGG，然后構(gòu)建重組質(zhì)粒并在大腸桿菌中表達蛋白，制備鼠源的多克隆抗體。結(jié)果表明 M

3、bov_0579基因編碼的MbovP579脂蛋白是一個穩(wěn)定、敏感、特異的抗原，能用于檢測自然感染或疫苗免疫的牛。其特異性通過與其同源性最高的無乳支原體、大腸桿菌、鼻氣管炎病毒、流行性腹瀉病毒蛋白的無交叉反應來驗證。Mbov_0579是一個功能未知的基因，在無乳支原體和其他病原菌中都沒有發(fā)現(xiàn)其同源基因，因此，rMbovP579蛋白適于建立間接ELISA方法。測定其ROC曲線分析閾值為0.442，此方法能對在感染后7天檢測到血清反應，且對于

4、臨床樣品的敏感性為90.2％（95％CI：83.7％，94.3％），特異性為97.8（95％CI：88.7％，99.6％）。其他比較研究表明這種ELISA的診斷和分析靈敏度都顯著高于商品化試劑盒（p<0.01）。
　　另外，TX-114提取的M. bovis HB0801株膜蛋白和M. bovis-150株膜蛋白通過雙向電泳、免疫印跡、MALDI-ToF和 LC-MS/MS技術(shù)分析鑒定出19個差異表達蛋白，其中12個蛋白通過MAL

5、DI-ToF質(zhì)譜鑒定，另外7個通過鳥槍法LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定。通過熒光定量 PCR方法鑒定出7個差異表達蛋白與雙向電泳鑒定的出的蛋白趨勢保持一致。總結(jié)：本研究發(fā)現(xiàn)了牛支原體的一個新的抗原蛋白 MbovP579，并建立了特異性和敏感性良好的適合早期診斷的間接 ELISA方法。此外，通過免疫蛋白質(zhì)組學和 MALDI-ToF和LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合發(fā)現(xiàn)了2個抗原脂蛋白（由Mbov_0730和Mbov_0732編碼）可以作為分子標