生殖支原體GlpK和GlpO定位及酶活性與細(xì)胞毒性研究.pdf

1、研究背景:
　　生殖支原體(Mycoplasma genitalium，Mg)是目前能在無生命條件下生長的最小原核細(xì)胞型微生物，可引起急慢性尿道炎、陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、輸卵管性不孕等多種疾病，并且作為AIDS相關(guān)支原體與患者的死亡密切相關(guān)。因此，開展對(duì)Mg的致病機(jī)制研究有利于提高對(duì)Mg相關(guān)疾病的認(rèn)識(shí)和治療。
　　到目前為止，與其它致病菌相比，在支原體中至今未發(fā)現(xiàn)類似于毒素、侵襲素、溶細(xì)胞素等典型的毒力因子，這主要是由

2、于支原體基因組小，僅進(jìn)化有維持基本生命功能的遺傳物質(zhì)。因此，支原體可能通過內(nèi)源性結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物作為毒性效應(yīng)器從而發(fā)揮其致病作用。近年研究表明，支原體的致病性與其碳代謝密切相關(guān)，并且不同的支原體利用的碳源有所不同。越來越多的研究表明，許多微生物擁有一套完整的甘油利用系統(tǒng)，甘油可能涉及到其多種病理生理及致病過程。因此本課題擬選取Mg甘油代謝的兩個(gè)主要活性酶GlpK和GlpO，研究其定位和酶活性以及參與Mg細(xì)胞毒性中的作用。
　　研究

3、目的:
　　純化出GlpK蛋白和抗GST-GlpK抗體，檢測(cè)GlpK酶活性和GlpK參與Mg細(xì)胞毒性中的作用;純化出GlpO蛋白和抗GST-GlpO抗體，檢測(cè)GlpO定位與酶活性和GlpO參與Mg細(xì)胞毒性中的作用。
　　研究方法:
　　1、Mg GlpK的甘油激酶活性
　　構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX6p-1/GlpK，誘導(dǎo)表達(dá)GST-GlpK融合蛋白，純化后免疫BALB/c小鼠取抗血清，進(jìn)行鑒定和抗體效價(jià)測(cè)定，純化

4、pAb;純化出GlpK蛋白，檢測(cè)其酶活性及溫度和pH的影響。
　　2、Mg GlpO的細(xì)胞定位及3-磷酸甘油氧化酶活性
　　構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX6p-1/GlpO，誘導(dǎo)表達(dá)GlpO-GST融合蛋白，純化后免疫BALB/c小鼠取抗血清，進(jìn)行鑒定和抗體效價(jià)測(cè)定，純化pAb;純化出GlpO蛋白，檢測(cè)其酶活性及溫度和pH的影響;分離Mg膜蛋白和胞漿蛋白，分析GlpO蛋白的細(xì)胞定位。
　　3、GlpK和GlpO對(duì)細(xì)胞毒性的

5、調(diào)控作用
　　電轉(zhuǎn)化構(gòu)建、篩選和鑒定GlpK和GlpO功能缺陷株;濕重法繪制Mg的碳源生長曲線;Western blotting檢測(cè)碳源對(duì)GlpK或GlpO表達(dá)的影響;結(jié)合抗體抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)甘油代謝下Mg產(chǎn)生H2O2的量，觀察HeLa細(xì)胞的毒性變化和HeLa細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　研究結(jié)果:
　　1、PCR擴(kuò)增出1524 bp目的片段，雙酶切和測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建出pGEX6p-1/GlpK重組質(zhì)粒，成功表達(dá)了83 kD

6、a的可溶性目的蛋白，純化目的蛋白免疫BALB/c小鼠制備獲得pAb，效價(jià)可達(dá)1∶16000;GST-GlpK融合蛋白經(jīng)酶切后，純化出57 kDa的GlpK靶蛋白，測(cè)定其甘油激酶活性為1.73 U/mL，且隨溫度和pH值升高而升高。
　　2、PCR擴(kuò)增出1152 bp目的片段，雙酶切及測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建出pGEX6p-1/GlpO重組質(zhì)粒，成功表達(dá)出68 kDa的可溶性目的蛋白，純化后目的蛋白免疫BALB/c小鼠制備獲得pAb，其效價(jià)

7、為1∶32000; GST-GlpO融合蛋白經(jīng)酶切后純化出42 kDa的GlpO靶蛋白，測(cè)定其3-磷酸甘油氧化酶活性為4.26 U/mL，40℃和pH7時(shí)活性最高;GlpO蛋白在Mg胞膜和胞漿中均表達(dá)，但大部分位于胞漿中。
　　3、電轉(zhuǎn)化后未篩選出GlpK和GlpO突變株;在葡萄糖下Mg生長迅速，在未加碳源或甘油下生長緩慢;甘油組和抗GST-GlpK抗體組Mg產(chǎn)生的H2O2明顯高于未加甘油組和抗GST-GlpO抗體組;甘油組和抗G

8、ST-GlpK抗體組的HeLa細(xì)胞存活率明顯低于未加甘油組和抗GST-GlpO抗體組;甘油組的HeLa細(xì)胞胞內(nèi)檢測(cè)出大量的H2O2和ROS，未加甘油組和抗GST-GlpO抗體組未檢測(cè)出。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建出pGEX6p-1/GlpK和pGEX6p-1/GlpO重組質(zhì)粒，并成功表達(dá)出GST-GlpK和GST-GlpO重組蛋白。
　　2、GlpK具有甘油激酶活性;GlpO為跨膜蛋白，具有3-磷酸甘油氧化酶活性。