綿羊肺炎支原體GlpO FAD結合位點的驗證及該位點不同Gly對其活性的影響.pdf

1、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)是引發(fā)綿羊傳染性胸膜肺炎的主要致病菌。課題組前期對綿羊肺炎支原體Y98株甘油3-磷酸氧化酶(glycerol3-phosphate oxidase，GlpO)的研究發(fā)現(xiàn)，其編碼基因全長1，134bp，編碼377個氨基酸;并證明了該蛋白位于細胞膜上，且能夠催化底物甘油3-磷酸生成DHAP及H2O2。
　　研究認為，GlpO是以CH-OH基團為供體的氧化還原酶類，

2、為黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴型氧化酶。GlpO是肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）、絲狀支原體絲狀亞種SC型（Mycoplasma mycoides subsp.mycoides SC）標準株PG1、雞敗血支原體（Mycoplasmagallisepticum）等支原體致病的毒力因子之一，主要參與甘油代謝途徑，可氧化甘油3-磷酸(glycerol3-phosphate，G3P)產(chǎn)生H2O2，引起炎癥反應

3、導致細胞死亡。
　　氨基酸序列同源比對分析發(fā)現(xiàn)，Y98株GlpO與SC型標準株PG1的GlpO、肺炎支原體的GlpD相似性分別達到64％、62％，且在其第15-20位的氨基酸也存在一個可能的FAD結合位點結構域Gly15-Ala16-Gly17-Ile18Ile19-Gly20。在對FAD結合位點結構研究認為，Gly對維持結構的穩(wěn)定性及其識別起著關鍵作用。因此，本實驗采用PCR擴增方法獲得了MO GlpO可能的FAD結合位點的缺失

4、突變體及該位點上Gly15、Gly17、Gly20的單個Gly缺失突變體，對MO GlpO FAD結合位點進行驗證，不同位點Gly對其活性的影響進行研究。主要研究結果如下:
　?、倮脤嶒炇仪捌跇嫿ǖ膒ET28a-glpO載體為模板，采用大引物PCR法獲得glpO FAD結合位點缺失突變體glO△FAD片段，并將其連接至pET32a表達載體;以pET32a-glpO為模板，通過一步反向PCR法獲得三種FAD結合位點單個Gly缺失突

5、變體pEg△G15、pEg△G17、pEg△G20。
　　②將四種GlpO突變體重組質粒轉化到BL21(DE3)宿主菌，誘導重組蛋白表達，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測，目的蛋白均以包涵體形式存在，大小約為60 kD。利用6M尿素將包涵體蛋白溶解，設定4M、2M、0M尿素梯度對突變體蛋白及課題組前期表達的GlpO蛋白進行處理，成功獲得復性后GlpO及其突變體重組蛋白。
　?、垡詮托院驡lpO蛋白為對照，檢測

6、突變體蛋白的氧化酶活性。發(fā)現(xiàn)體外條件下，加入FAD時，GlpO蛋白具有氧化酶活性，能夠以甘油3-磷酸為底物催化產(chǎn)生H2O2，不加入FAD時無H2O2產(chǎn)生;而無論是否加入FAD，GlpO整個FAD結合位點缺失及單個Gly缺失突變體重組蛋白都不能催化甘油3-磷酸產(chǎn)生H2O2，不具有氧化酶活性。驗證了Gly15-Ala16-Gly17-Ile18-Ile19-Gly20確為GlpO的FAD結合位點序列，且Gly15、Gly17、Gly20對該

7、位點與FAD的結合起著關鍵作用。
　?、軐O、GlpO及四種GlpO突變體蛋白分別作用于小鼠肺臟上皮TC-1細胞，經(jīng)MTT和ROS檢測，發(fā)現(xiàn)無論是否添加甘油，F(xiàn)AD結合位點缺失突變體及該位點的三種單個Gly缺失突變體重組蛋白都不能引起細胞產(chǎn)生ROS，均對細胞的存活率無明顯影響。表明FAD結合位點6個氨基酸缺失或該位點單個Gly缺失都會使GlpO失去酶活性。
　　本實驗通過構建四種GlpO缺失突變體，在蛋白水平、細胞水平對其