量子點標(biāo)記技術(shù)檢測肺炎支原體抗原方法的建立.pdf

1、近年來，量子點憑借其自身獨特的光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性越來越受到人們的重視。量子點（quantum dots，QDs）是一種半導(dǎo)體納米晶體，與傳統(tǒng)熒光染料相比，具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、發(fā)光效率高，發(fā)光顏色可調(diào)，并且具有較高的熒光強度和光穩(wěn)定性，能夠承受多次的激發(fā)和光發(fā)射等一系列優(yōu)點，在實驗室診斷中有著廣泛的應(yīng)用前景。
　　 肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，Mp)不僅引起急性呼吸道疾病，還引起其它多系統(tǒng)、

2、多器官的肺外并發(fā)癥。由于Mp無細(xì)胞壁，故其引起感染的治療與其它細(xì)菌和病毒感染在治療方法上有所不同，因此，Mp感染的病原學(xué)診斷對于疾病的及時正確治療有重要意義。對Mp的實驗室診斷，主要是通過支原體分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)等方法，而這些方法存在著各自不同的優(yōu)缺點，因此，到目前為止，國內(nèi)外對Mp的實驗室診斷沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究基于QDs標(biāo)記技術(shù)，針對Mp抗原建立了一種快速、簡易可靠，而且特異的診斷方法。
　　 方法:

3、　　 1、肺炎支原體P1重組蛋白多克隆抗體的制備與純化
　　 經(jīng)P1重組蛋白免疫家兔獲得抗血清后，采用硫酸銨沉淀法和離子交換層析法對其進(jìn)行純化，通過聚丙烯凝膠電泳檢測其分子量與純度。
　　 2、量子點與肺炎支原體P1重組蛋白多克隆抗體的偶聯(lián)
　　 采用碳二亞胺鹽連接法，使量子點QD605的羧基與抗體上的氨基反應(yīng)，形成肽鍵。然后用離心法純化偶聯(lián)產(chǎn)物，純化后采用膜直接免疫熒光法驗證量子點QD605與抗體的偶聯(lián)，并采

4、用熒光分光光度法對其熒光效率進(jìn)行檢測。
　　 3、偶聯(lián)產(chǎn)物檢測肺炎支原體
　　 采用直接免疫熒光法用偶聯(lián)產(chǎn)物與待檢測抗原反應(yīng)，洗去偶聯(lián)產(chǎn)物后進(jìn)行熒光檢測。同時對其敏感性和特異性進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1、肺炎支原體P1重組蛋白多克隆抗體的純化鑒定結(jié)果
　　 P1重組蛋白免疫家兔獲得的抗血清經(jīng)硫酸銨沉淀法和離子交換層析法純化后，在聚丙烯凝膠電泳上可見在58KD處有明顯的一條帶。
　　

5、 2、量子點與肺炎支原體P1重組蛋白多克隆抗體的偶聯(lián)結(jié)果
　　 膜直接免疫熒光法表明只有偶聯(lián)產(chǎn)物與Mp抗原反應(yīng)在紫外燈下發(fā)熒光，單獨的量子點QD605、未標(biāo)記的抗體及其它對照與Mp抗原反應(yīng)在紫外燈下均不發(fā)熒光，驗證了量子點QD605與抗體的偶聯(lián)。然后采用熒光分光光度法對量子點QD605及偶聯(lián)產(chǎn)物的熒光效率進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示兩者并沒有明顯的改變，說明偶聯(lián)產(chǎn)物的熒光強度沒有受到偶聯(lián)過程的影響。
　　 3、本研究敏感性及特異性