沙眼衣原體CPAF免疫活性區(qū)重組蛋白的表達(dá)及在臨床診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目的：構(gòu)建含沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,Ct）蛋白酶樣活性因子（chlamydial protease-like activity factor, CPAF）免疫活性區(qū)（200～338 aa）基因的重組表達(dá)體，在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行免疫原性和抗原性分析，建立間接ELISA法和IIF法檢測(cè)Ct感染的臨床標(biāo)本，分析其敏感性和特異性，為制備Ct臨床檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。 方法：通過(guò)生物信

2、息學(xué)分析和查閱資料，篩選并挑選Ct CPAF基因優(yōu)勢(shì)抗原表位，以D型Ct基因組DNA為模板，高保真聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的片斷，將其亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6p-2中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/CPAF，然后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE和 Western-Blot 分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物；重組蛋白經(jīng)稀釋透析復(fù)性后，用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱進(jìn)行純化，紫外吸收法測(cè)定純化蛋白濃度

3、。用純化的Ct CPAF重組蛋白包被微孔板，建立間接ELISA方法，檢測(cè)Ct參比血清和臨床Ct陽(yáng)性血清，同時(shí)與晶美公司Ct ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，根據(jù)重組蛋白與Ct陰、陽(yáng)性血清的反應(yīng)情況，評(píng)價(jià)該重組抗原在Ct感染血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)用純化的Ct CPAF重組蛋白免疫新西蘭兔，間接ELISA方法檢測(cè)免疫兔血清中Ct CPAF多克隆抗體的效價(jià)；并用溴化氰活化的瓊脂糖凝膠4B對(duì)抗血清進(jìn)行純化，純化后的抗血清作為一抗建立

4、間接ELISA法和IIF法測(cè)定臨床分泌物標(biāo)本中的Ct CPAF抗原，與PCR法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，評(píng)價(jià)該抗血清在臨床標(biāo)本抗原檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。 結(jié)果：軟件分析Ct CPAF基因的抗原表位選擇了Ct CPAF基因的674～1 090bp位堿基序列為目的基因（片段長(zhǎng)度為417bp，編碼139個(gè)氨基酸）；PCR擴(kuò)增得到大小約為400bp的目的片斷；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明其中插入片斷為Ct CPAF目的基因，測(cè)序結(jié)果與

5、Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，重組表達(dá)菌表達(dá)了一相對(duì)分子量（Mr）約為43×103的目的蛋白條帶，目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式存在；經(jīng)GST瓊脂糖凝膠FF純化柱純化獲得了純度在95％以上的重組蛋白。Western-blot檢測(cè)其能與Ct陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)；重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA法檢測(cè)Ct參考血清，其陰、陽(yáng)性符合率均為100％；用自建的間接ELISA法和晶美公司Ct

6、 ELISA試劑盒分別檢測(cè)250份陰、陽(yáng)性血清，兩種方法的符合率IgM為96.8％，IgG 為98.4％。利用純化的Ct CPAF重組蛋白免疫新西蘭兔, 間接ELISA法測(cè)定兔免疫血清特異性抗體效價(jià)在1:16 000以上；純化后的抗血清作為一抗建立間接ELISA法和IIF法檢測(cè)臨床分泌物標(biāo)本中的Ct CPAF抗原，建立的間接ELISA法及IIF法與上海復(fù)星公司Ct PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果符合率分別為91.90％和90.00％。 結(jié)

7、論： 1、成功構(gòu)建了pGEX-6p-2/ CPAF原核表達(dá)體，將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)后表達(dá)出了一相對(duì)分子量（Mr）約為43×103的重組蛋白； 2、Ct CPAF重組蛋白具有較好的免疫原性，能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體； 3、Ct CPAF重組蛋白具有良好的抗原性，能與Ct感染者陽(yáng)性血清特異性結(jié)合，可應(yīng)用于Ct血清學(xué)診斷； 4、以Ct CPAF重組蛋白免疫新西蘭兔制備的多克隆抗