重組人來源的IL4在畢赤酵母中的表達(dá)及其糖基化與其生物活性的關(guān)系.pdf

1、研究背景:人IL4是一種外分泌糖蛋白，具有抗腫瘤、抗炎作用，在某些炎癥和自身免疫病中具有潛在的應(yīng)用價值，可能成為防治自身免疫性糖尿病的藥物。但是，應(yīng)用單劑量的IL4有發(fā)熱、惡心嘔吐、鼻充血、腹瀉、厭食、體重增加和呼吸困難等副反應(yīng)。Ⅰ期臨床試驗表明靜脈注射最大耐受劑量的IL4，并未觀察到治療作用，單獨使用IL4沒有明顯的抗腫瘤作用，而合用其他制劑可見肺轉(zhuǎn)移腫瘤明顯轉(zhuǎn)歸。之前的研究幾乎是基于原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來源的重組IL4，沒有經(jīng)過翻譯后糖

2、基化修飾，這是否是造成IL4臨床治療受限的原因呢？近幾年來，重組蛋白技術(shù)及其臨床應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如畢赤酵母能夠成功表達(dá)分泌糖基化修飾的人源性重組蛋白，但是，糖基化對蛋白質(zhì)本身生物學(xué)活性與功能的影響是怎么的呢，目前在學(xué)術(shù)界尚無定論。重組人源性IL4在畢赤酵母中表達(dá)及其糖基化與生物學(xué)功能是否有直接關(guān)系，每個糖基化位點的貢獻(xiàn)是否一致，在國內(nèi)至今尚無有關(guān)這方面的研究。本課題旨在研究重組人來源的糖基化蛋白在畢赤酵母真核細(xì)胞表達(dá)系

3、統(tǒng)中的表達(dá)及糖基化與其生物學(xué)功能的關(guān)系。
　　研究目的:旨在研究畢赤酵母真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中人來源IL4糖基化蛋白的表達(dá)，明確糖基化對其蛋白的生物學(xué)功能的影響，為重組蛋白在臨床疾病治療中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。
　　研究方法:用PCR方法擴(kuò)增人全長IL4cDNA，PCR產(chǎn)物回收，DNA序列分析后克隆至酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA(Invitrogen，USA)Xho1/Xba1位點，
　　pPICZα-IL4并轉(zhuǎn)染Ecol

4、i(TOP10F，strain)，表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功后，將SacI酶切的線性質(zhì)粒用酵母轉(zhuǎn)染試劑盒(PichiaEasycomTransformationKit，Invitrogen，USA)轉(zhuǎn)染畢赤酵母X-33細(xì)胞，表達(dá)，純化，-80度保存。SDS-PAGE和westernblotting分別檢測IL4表達(dá)情況。N-glycanase(PNGaseF，NewEnglandBioLabs)處理IL4，并用點突變法分別突變?nèi)嗽葱訧L4糖基化位

5、點Asn38和Asn105位，制備質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染畢赤酵母細(xì)胞，表達(dá)，純化，-80度保存，分別用SDS-PAGE和westernblotting檢測IL4糖基化情況，并用質(zhì)譜進(jìn)一步證實Asn105位糖基化情況。提取的C57BL/6鼠脾細(xì)胞，磁珠分選，收集CD19+脾細(xì)胞，分為糖基化IL4組和去糖基化IL4組，用重組人源性IL4處理，37度共孵育16小時后流式檢測CD23表達(dá)情況。糖基化IL4組和去糖基化IL4組，細(xì)胞外分泌IL4和胞內(nèi)提取IL

6、4分別在4度、室溫、37度孵育3天、7天、10天，用westernblotting檢測。
　　研究結(jié)果:人源性糖基化蛋白IL4在真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母細(xì)胞中高表達(dá)，并分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中，SDS-PAGE和westernblotting結(jié)果顯示相對分子量約為34-50kDa的IL4分泌量逐漸增多并與96小時后下降。用PNGaseF處理后IL4分子量和對照組相比明顯減小，約為15kDa。經(jīng)過純化后獲得高純度的IL4蛋白。N38A，

7、N105L突變體DNA序列分析結(jié)果顯示突變正確。westernblotting結(jié)果顯示N38A突變株分泌蛋白分子量明顯減小，降至約15kDa，而N105L突變株分泌蛋白分子量無變化，仍為34-50kDa。質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步顯示N105L突變株分泌蛋白沒有發(fā)生糖基化。IL4生物活性檢測結(jié)果顯示，糖基化IL4和去糖基化IL4組B細(xì)胞CD23表達(dá)均上調(diào)，但是，和糖基化IL4組相比去糖基化IL4組上調(diào)B細(xì)胞CD23表達(dá)更明顯(p＜0.01)。蛋白穩(wěn)