小鼠LEAP-2在畢赤酵母中的表達及其活性鑒定.pdf

1、目的克隆小鼠肝表達抗菌肽-2(Liver-expressedantimicrobialpeptide-2，LEAP-2)基因編碼區(qū)的cDNA序列并進行序列測定，構建真核表達載體并在畢赤酵母GS115中表達，初步分析表達產(chǎn)物的活性。 方法從小鼠肝中提取總RNA，采用RT-PCR技術，獲得mLEAP-2基因編碼區(qū)的cDNA，擴增出mLEAP-2的前肽基因和成熟肽基因，重組入克隆載體pUCm-T，構建重組克隆載體pUCm-T-P和pU

2、Cm-T-M，轉化進E.coliBL21，通過菌落PCR篩選，選擇陽性克隆并測序。將二基因重組入真核表達載體pPIC9，構建重組表達載體pPIC9-P和pPIC9-M，通過菌落PCR篩選及限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoRI鑒定，篩選陽性重組子；將線性化后的重組質粒pPIC9-P和pPIC9-M氯化鋰轉化巴斯德畢赤酵母GS115，利用選擇性培養(yǎng)基和PCR技術篩選獲得陽性克隆；陽性菌落用甲醇誘導表達，前肽和成熟肽獲得分泌表達，檢測表達產(chǎn)物的抗

3、菌活性。 結果將所得序列與GenBank提供的序列比較，基因序列完全相同；經(jīng)甲醇誘導48h后，15％SDS-PAGE分析，表達出Mr14000和Mr11000的蛋白，通過初步活性分析，成熟肽具有一定的抑菌活性，其表達和活性受多種因素影響。 結論mLEAP-2基因的前肽和成熟肽在酵母中得到分泌表達；成熟肽具有一定的抑菌活性；成熟肽在pH6、甲醇量0.5％～1％、接種后30h再誘導時表達量最大，而成熟肽的抑菌活性與其含量有關