CTB-LK在畢赤酵母和向日葵中的表達、檢測及其活性分析.pdf

1、血栓性疾病，尤其是心、腦血管血栓性疾病，已成為我國死亡率最高的疾病之一，嚴重危害人類健康。蚓激酶(Lumbrokinase，LK)是從蚯蚓體內(nèi)提取的一種具有纖溶活性的蛋白水解酶，在臨床上對多種血栓疾病具有較好療效。然而LK的口服吸收利用度不高以及在胃腸道內(nèi)極易被降解，相對來說限制了其在臨床上的應(yīng)用。而霍亂毒素B亞單位(cholera toxin B subunit，CTB)是由霍亂弧菌產(chǎn)生的無毒的受體結(jié)合亞單位，具有結(jié)合真核細胞上的神經(jīng)

2、節(jié)苷脂受體的功能，目前大量研究集中在將其與目的抗原偶聯(lián)或表達成融合蛋白后，使機體產(chǎn)生更強的抗特性抗原的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。本文我們利用CTB的作用特點來探索其在非抗原抗體藥物蛋白方面的是否具有較好的佐劑效果，以期利用CTB佐劑來提高LK的口服吸收利用率。
　　 在研究中我們構(gòu)建了LK表達載體pPIC9k-CTB-LK，并在CTB與LK之間引入了弗林蛋白酶水解位點，通過該位點的引入使CTB完成佐劑使命后被小腸上皮細胞中富含的弗林蛋

3、白酶切掉，使得其與LK分開，同時在CTB下游添加(GGGGS)3 Linker序列，使得融合蛋白CTB-LK翻譯表達后可以得到正確折疊。CTB-LK在畢赤酵母中得到高效表達，經(jīng)過分離純化后，通過纖維蛋白平板法實驗和小鼠血栓模型的構(gòu)建，說明LK蛋白提取物和CTB-LK蛋白提取物都具有LK纖維活性和抑制小鼠血栓形成的功效，而且CTB可以發(fā)揮其增強LK口服吸收利用的效果。此外，本實驗中我們觀察到畢赤酵母表達CTB-LK后可以催化前體硅酸鈉形成

4、二氧化硅復(fù)合物，進而對畢赤酵母進行包埋，這種包埋方法簡單易行，且能體現(xiàn)出傳統(tǒng)細胞包埋的特點。
　　 最后，我們使用含Marker Free植物表達載體pX6-CTB-LK的農(nóng)桿菌侵染向日葵子葉后得到轉(zhuǎn)基因向日葵植株，以向日葵基因組DNA作為模板進行PCR檢測，以及以向日葵基因組RNA作為模板進行RT-PCR檢測，說明外源目的基因CTB-LK已經(jīng)成功整合到向日葵基因組中，并實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，最終獲得轉(zhuǎn)基因種子兩顆。
　　 總之，本