NUDC在畢赤酵母中的表達(dá)及其活性的進(jìn)一步研究.pdf

1、巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控。如白介素1、白介素3、白介素6、白介素11、干細(xì)胞因子、粒集落刺激因子、血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)等。TPO通過與巨核細(xì)胞表面的血小板生成素受體(Myeloproliferativeleukemia，MPL)結(jié)合，引導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)通路，在體外刺激巨核細(xì)胞集落(Colonyformingunitsofmegakaryocyte，CFU-MK)形成，在體內(nèi)升高

2、血小板的水平。然而，在巨核細(xì)胞成熟和血小板形成的過程中，TPO并不是必須的細(xì)胞因子。因?yàn)樵赥PO敲除鼠的實(shí)驗(yàn)中，雖然巨核細(xì)胞和血小板的數(shù)量減少85-90％，但并不影響血小板的功能。這說明在血小板的形成過程中可能存在其它因子的作用。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，使用Mpl的胞外區(qū)(Mpl-EC)作為誘餌蛋白，用酵母雙雜交系統(tǒng)，從人體胎肝cDNA文庫(kù)中分離到了人核遷移蛋白(HumannucleardistributionC，hNUDC)與M

3、pl的胞外區(qū)相互作用。隨后通過GSTpull-down、免疫沉淀和熒光定位試驗(yàn)證明了hNUDC是Mpl的另一個(gè)配體。NUDC首先是在絲狀真菌Aspergillusnidulans中作為調(diào)控核遷移的nud基因發(fā)現(xiàn)的，A.nidulansNUDC基因在人中的同源物(hNUDC)已被克隆。hNUDC是一種在多種細(xì)胞中與微管動(dòng)力中心結(jié)合并且相互作用的多功能蛋白。由于NUDC與TPO都與MPL結(jié)合，而兩者又沒有相同序列，為了檢測(cè)NUDC是否與TP

4、O具有相同的生物活性，在前期研究成果的基礎(chǔ)上，克隆了人核遷移蛋白(hNUDC)和小鼠核遷移蛋白(mNUDC)基因，在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了hNUDC和mNUDC，通過金屬親和層析柱純化出了蛋白hNUDC-His和mNUDC-His，并且對(duì)hNUDC和mNUDC的生物活性作進(jìn)一步的研究。 首先以人臍血CD34+細(xì)胞無血清液體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)hNUDC-His可以顯著增加巨核細(xì)胞的數(shù)目和促進(jìn)巨核細(xì)胞的成熟。并且在無血清半固體培養(yǎng)時(shí)可以刺

5、激形成巨核細(xì)胞集落(CFU-MK)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示出hNUDC-His可以明顯增加巨核細(xì)胞的DNA倍性和體外產(chǎn)生的血小板的數(shù)量。在正常小鼠和骨髓抑制小鼠體內(nèi)注射的實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步證明了hNUDC-His具有提高體內(nèi)血小板數(shù)量的作用。 接著在以鼠巨核細(xì)胞研究mNUDC-His的活性時(shí)發(fā)現(xiàn)mNUDC-His具有體外促進(jìn)巨核細(xì)胞的成熟，體內(nèi)促進(jìn)血小板升高的作用。mNUDC-His顯示出了與hNUDC-His同樣的生物活性。