進(jìn)境向日葵有害生物風(fēng)險分析及向日葵莖潰瘍病菌快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、本文對進(jìn)境向日葵有害生物進(jìn)行了風(fēng)險分析,并對向日葵莖潰瘍病菌的生物學(xué)特性和PCR檢測方法進(jìn)行了研究,建立了該病菌常規(guī)PCR和實時熒光PCR檢測方法。通過室內(nèi)毒力的測定,為該菌的檢疫處理提供了理論基礎(chǔ)。
　　本文按照FAO的國際植物檢疫措施標(biāo)準(zhǔn)第2號——有害生物風(fēng)險分析準(zhǔn)則,對進(jìn)境向日葵進(jìn)行了風(fēng)險分析。通過風(fēng)險評估,篩選出檢疫性有害生物7個,其中真菌4個,病毒2個,雜草1個,即向日葵白銹病菌、向日葵莖潰瘍病菌、向日葵黑莖病菌、向日葵

2、黃萎病菌、向日葵環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒、向日葵列當(dāng),除了向日葵莖潰瘍病菌和向日葵黑莖病菌為高等風(fēng)險外,其余風(fēng)險均為中等。通過檢疫審批、藥劑拌種、入境口岸檢疫和隔離試種等管理措施,可以將輸入向日葵的風(fēng)險降至可接受的水平。
　　依據(jù)風(fēng)險分析結(jié)果,選取向日葵莖潰瘍病菌(Phomopsis helianthi)進(jìn)行深入的研究。為了建立常規(guī)的生物學(xué)檢測方法,對該病菌的培養(yǎng)條件和生態(tài)適應(yīng)性中的營養(yǎng)條件進(jìn)行研究。在不同培養(yǎng)條件(包括培養(yǎng)基、碳源

3、、氮源、溫度、酸堿度、光照等條件)和營養(yǎng)條件下,對該菌培養(yǎng)7d,觀察其生長狀況并測量菌落直徑大小。用SPSS12.0軟件進(jìn)行相應(yīng)的計算處理、統(tǒng)計分析。該病菌在PDA、CMA培養(yǎng)基上生長較好,在改良的查彼培養(yǎng)基和WA培養(yǎng)基上生長較慢。該病菌能充分利用酵母膏和硝酸鉀,在6℃～34℃溫度范圍內(nèi)正常生長,最適生長溫度為23℃～26℃。適宜生長酸堿度為pH4.0～11.0,最適酸堿度為pH5.0～10.0。在全光照培養(yǎng)條件下有利于菌絲的生長。

4、r>　　用真菌通用引物ITS4/ITS5對向日葵莖潰瘍病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、酶切分析和測序,并采用4種限制性內(nèi)切酶對ITS區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析,為該菌的鑒定提供了一種方法。用DNAMAN軟件分別設(shè)計出了檢測該病菌的特異性引物PHDF1/PHDF2、PHDF3/PHDF4和TaqMan探針PHDF5,首次在國內(nèi)建立了該病菌普通PCR和實時熒光PCR方法,通過體系優(yōu)化和檢測結(jié)果顯示,這兩對引物均可將向日葵莖潰瘍病菌與其他