重組人FLT-3配體胞外區(qū)在畢赤氏酵母中的表達與鑒定.pdf

1、天津醫(yī)科大學博士學位論文重組人FLT3配體胞外區(qū)在畢赤氏酵母中的表達與鑒定姓名：黃宗堂申請學位級別：博士專業(yè)：腫瘤學指導教師：郝希山2002.5.1查堡墮型查竺堡主!!!至蘭堡圣我們根據(jù)畢赤氏酵母偏愛密碼子人工合成的FL胞外區(qū)cDNA序列經(jīng)測序。目的片段的編碼序列完全正確。重組FL胞外區(qū)cDNA以粘性末段連接方式定向克隆至pPIC9K質(zhì)粒的EcoRI和NotI酶切位點，插入到質(zhì)粒中的a—MF分泌信號序列之后。重組質(zhì)粒pPIC9KFL經(jīng)測

2、序，插入片段大小、位置完全正確。Southern雜交實驗結(jié)果證實目的基因已整和插入到宿主菌KM7l的基因組內(nèi)。Northern雜交實驗結(jié)果表明KM71pPIC9KFL菌株中經(jīng)O5％甲醇誘導后，目的基因已成功表達，而且目的基因表達量隨誘導時間延長而增加。經(jīng)O5％甲醇誘導表達后，培養(yǎng)液上清中檢測到表達產(chǎn)物。Western雜交實驗出現(xiàn)了可被抗體特異性識別的雜交帶，證實此條帶即為重組畢赤氏酵母KM71pPIC9KFL分泌表達的重組FL蛋白。SD

3、SPAGE電泳結(jié)果顯示，KM71pPIC9KFL菌株表達的重組FL蛋白分子量大約為20KD。經(jīng)SDSPAGE凝膠掃描半定量分析，誘導表達96小時后，重組FL蛋白分泌量達到108mg／L。PNGaseF不完全酶切處理后重組FL蛋白依次脫除1至2個糖基，和未脫糖基產(chǎn)物共形成三個雜交帶，每個雜交帶分子量相差大約1KD，提示每個糖基化位點上大約有69個糖戡目的蛋白徹底脫糖基后，分子量大約為18KD，與1原核表達產(chǎn)物大小相當J實驗結(jié)果說明畢赤氏酵