重組人載脂蛋白AI米蘭突變體在畢赤酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、人載脂蛋白Al米蘭突變體(apolipoproteinA I—milano,AIM)是ApoAI的天然突變體，首次發(fā)現(xiàn)于意大利米蘭地區(qū)一個(gè)村莊的部分居民中，其血漿中ApoA I的第173位Arg突變成Cys。攜帶AIM的人群其心血管類疾病的發(fā)病率大大低于正常人群。研究表明，AIM具有比ApoAI更強(qiáng)的抗動(dòng)脈粥樣硬化癥的作用。因此AIM有可能成為一種新型的治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化癥等疾病的藥物，具有臨床應(yīng)用前景。 畢赤酵母系統(tǒng)已經(jīng)普

2、遍用于外源蛋白的表達(dá)。用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)rAIM，有利于rAIM的大規(guī)模生產(chǎn)。將pPIC9k-apoAI質(zhì)粒上的apoAI cDNA的第173位Arg密碼予突變成Cys密碼子，得到重組質(zhì)粒pPIC9k-apoAI-milano，用Bg/II線性化，電轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115菌株，篩選獲得G418高抗性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo)，上清液用SDS-PAGE與Western blotting檢測(cè)，有明顯r

3、AIM表達(dá)，但是其C末端發(fā)生部分降解。我們嘗試對(duì)酵母工程菌株Amp13發(fā)酵條件的優(yōu)化，在搖瓶培養(yǎng)時(shí)，將BMMY培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到7.0，蛋白胨用量增加到4％，添加0.1％Arg、0.1％Ala和5mmol/L的EDTA，將誘導(dǎo)溫度降低至25℃，誘導(dǎo)時(shí)間為3天時(shí)，使rAIM的降解得到有效控制，其表達(dá)水平達(dá)到約70mg/L發(fā)酵液，其中全長(zhǎng)的rAIM所占的比例達(dá)到約80％。我們還采用冷丙酮沉淀法初步純化了酵母工程菌發(fā)酵液中的rAIM，并證明