重組載脂蛋白的A-I及其半胱氨酸突變體的功能研究.pdf

1、第一部分：重組載脂蛋白A-I半胱氨酸突變體N74C對apoE-/-小鼠頸總動脈套環(huán)誘導(dǎo)斑塊和血管重塑的抑制作用
　　 大量的動物實驗和流行病學(xué)調(diào)查表明血漿高密度脂蛋白(HDL)及其主要蛋白成分-載脂蛋白A-I(apoA-I)的含量與冠脈疾病的發(fā)生呈負相關(guān)，是冠心病和動脈粥樣硬化(As)最為重要的保護因素之一。成熟型apoA-I最顯著的特征是含有8個22個氨基酸和2個11個氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)序列之間被脯氨酸隔開。Apo

2、A-I的天然半胱氨酸突變體apoA-IMilan。(apoA-IM)和apoA-IPari。均表現(xiàn)出增強的心血管保護活性。ApoA-IM和apoA-IPui。突變位點分別位于螺旋6和螺旋5的雙性α螺旋親-疏水性交界面上，突變位點在多肽鏈位置上恰好相隔22個氨基酸殘基。根據(jù)突變發(fā)生的特殊位置，我們實驗室設(shè)計并構(gòu)建了七種半胱氨酸突變體：A-I(S52C)，A-I(N74C),A-I(K107C),A-I(G129C),A-I(R173C),

3、A-I(K195C)及A-I(S228C),并對其單體的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、脂質(zhì)結(jié)合能力、體外抗氧化和促膽固醇流出等功能進行了研究。在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥小鼠動物模型中，與野生型apoA-I(wide type apoA-I，apoA-Iwt)和apoA-IM相比，A-I(N74C)突變體靜脈注射顯著抑制炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的表達和內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺組織損傷。

4、r>　　 實驗?zāi)康模?br>　　 本研究利用pET原核表達和純化的重組載脂蛋白apoA-lwt，A-I(N74C)和apoA-IM，采用頸總動脈套環(huán)的apoE-/-小鼠作為動物模型，通過與apoA-Iwt和apoA-IM進行比較，探討A-I(N74C)半胱氨酸突變體對小鼠頸動脈粥樣硬化和血管重塑的保護作用及可能機制，并為我們深入理解apoA-I結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 實驗方法：
　　 利用pET原核表達系統(tǒng)

5、對重組載脂蛋白apoA-lwt，A-I(N74C)和apoA-IM進行表達，快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng)(AKTA FPLC System)對目的蛋白進行純化，獲得高純度的重組蛋白(＞90％)用于后續(xù)實驗研究。純化后apoA-lwt，A-I(N74C)和apoA-IM蛋白經(jīng)Pierce親和柱去除重組蛋白內(nèi)殘量內(nèi)毒素，鱟試劑法檢測內(nèi)毒素合格后與大豆卵磷脂包裝形成重組高密度脂蛋白(rHDL)：rHDLwt，rHDL74和rHDLmilano。利用

6、銅離子介導(dǎo)的低密度脂蛋白(LDL)氧化系統(tǒng)和硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)分析法檢測apoA-Iwt及其半胱氨酸突變體A-I(N74C)和apoA-IM的體外抗LDL氧化能力；將重組載脂蛋白與THP-1來源的巨噬細胞共同孵育培養(yǎng)，分別利用油紅O染色和脂質(zhì)抽提法分析A-I(N74C)半胱氨酸突變對氧化LDL(oxLDL)的巨噬細胞吸收和細胞內(nèi)脂質(zhì)累積的影響；28只雄性apoE-/-小鼠頸動詠套環(huán)快速、定點誘導(dǎo)頸部動脈粥樣硬化和血管重塑；

7、頸動脈套環(huán)apoE-/-小鼠隨幾分為五組：生理鹽水對照組(0.3ml;n=5)、磷脂對照組(134mg/kg;n=5)、rHDLwt組（40mg/kg；n=6）、rHDL74組(40mg/kg；n=6)和rHDLmilano組(40mg/kg；n=6)。各組動物頸動脈套環(huán)后5天給予生理鹽水、磷脂和rHDLs尾靜脈注射，每隔10天注射一次，共三次。最后一次注射后24小時，摘眼球取血，分離血清，采用酶法測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(T

8、G)和HDL膽固醇(HDL-C)含量；血清鐵還原能力分析法(FRAS)檢測apoE-/-小鼠血清總抗氧化能力；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清炎癥因子IL-6的含量；apoE-/-小鼠固定，PBS灌流，取雙側(cè)頸總動脈置于10％中性緩沖福爾馬林中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光鏡觀察rHDL74靜脈注射對頸As面積、內(nèi)中膜比值和斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量的影響；利用大鼠抗小鼠F4/80單克隆抗體，免疫組化檢測小鼠頸動脈斑塊內(nèi)巨噬細胞的含量。

9、
　　 實驗結(jié)果：
　　 體外抗LDL氧化實驗：與apoA-lwt相比，重組蛋白A-I(N74C)和apoA-IM顯著抑制銅離子介導(dǎo)的LDL氧化，并且A-I(N74C)和apoA-IM的抗氧化活性相似。為了排除A-I(N74C)的抗氧化作用與半胱氨酸突變引入游離巰基的關(guān)系，我們在反應(yīng)體系中加入與apoA-Iwt摩爾濃度相同的還原型谷胱甘肽(GSH)。重組蛋白apoA-Iwt、A-I(N74C)和apoA-IM的半數(shù)抑制濃

10、度(IC50)分別達到264、72和67μg/ml，而apoA-lwt+GSH組的半數(shù)抑制濃度降為238μg/ml。
　　 細胞內(nèi)脂質(zhì)累積實驗：油紅O染色結(jié)果顯示apoA-lwt組巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)累積面積比對照組減少30.65％，而A-I(N74C)和apoA-IM組分別減少56.78％和61.08％。有機溶劑抽提細胞內(nèi)脂質(zhì)，A-I(N74C)和apoA-IM組細胞內(nèi)脂質(zhì)含量比apoA-Iwt組顯著降低，與油紅O染色結(jié)果相一致。提

11、示重組蛋白A-I(N74C)能夠抑制oxLDL的細胞吸收和降低細胞內(nèi)脂質(zhì)累積，其抑制作用與apoA-IM相似。
　　 體內(nèi)動物實驗：rHDL74靜脈注射顯著降低血清TC和非HDL-C水平，其降血脂作用與rHDLwt組相似，低于rHDLmilano組；與rHDLwt和rHDLmilano組相比，rHDL74給藥組apoE-/-小鼠血清總抗氧化能力顯著升高；rHDLwt靜脈注射24小時后，血清IL-6水平升高至315.0±32.5p

12、g/ml。與rHDLwt組相比，rHDLmilano和rHDL74靜脈注射分別使小鼠血清IL-6水平降低17％和32％，達到261.5±35.2pg/ml和215.6±19.4pg/ml。提示rHDL74具有比rHDLwt和rHDLmilano更強的抗炎和抗氧化功能；與rHDLwt組相比，rHDL74靜脈注射顯著降低頸動脈粥樣硬化斑塊面積和血管內(nèi)中膜比值、減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)和巨噬細胞含量，其體內(nèi)抗As和血管重塑作用與rHDLmilano相似

13、。
　　 結(jié)論：
　　 1.A-I(N74C)半胱氨酸突變能夠增強重組蛋白的體外抗LDL氧化能力，其抗氧化功能與apoA-IM相似。A-I(N74C)突變體抗氧化活性的增強并不僅是半胱氨酸突變引入游離巰基的結(jié)果，可能與突變體本身結(jié)構(gòu)和功能的改變以及突變體蛋白與反應(yīng)底物之間的相互作用有關(guān)。
　　 2.A-I(N74C)半胱氨酸突變能夠抑制oxLDL的巨噬細胞吸收和降低細胞內(nèi)脂質(zhì)累積，其抑制作用與apoA-IM相似。

14、結(jié)合以前膽固醇流出實驗和體內(nèi)血脂分析結(jié)果，提示A-I(N74C)降低細胞內(nèi)脂質(zhì)累積作用不是通過促進細胞內(nèi)膽固醇流出過程，而是通過抑制LDL的氧化和oxLDL的細胞吸收。
　　 3.與rHDLwt和rHDLmilano組相比，rHDL74靜脈注射顯著降低血清IL-6水平和增強血清總抗氧化能力，提示A-I(N74C)半胱氨酸突變能夠顯著增強重組蛋白的體內(nèi)抗炎和抗氧化能力。
　　 4.與rHDLwt組相比，rHDL74靜脈注射

15、顯著降低apoE-/-小鼠頸As斑塊面積和血管內(nèi)中膜比值、減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)和巨噬細胞含量，其抗As和血管重塑作用與rHDLmilano相似。
　　 5.A-I(N74C)半胱氨酸突變體的抗As和血管重塑功能可能是來源于突變體蛋白增強的抗炎和抗氧化活性，而不是對膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程的促進功能。
　　 第二部分：重組高密度脂蛋白作為藥物載體的抗腫瘤實驗研究
　　 癌癥（惡性腫瘤）是對人類健康危害最嚴(yán)重的疾病之一。目前大多數(shù)

16、化療藥物仍存在不同程度對靶細胞的選擇性或藥物耐受性差、毒副作用強、水溶性不足等缺陷，使抗腫瘤藥物在靶細胞中難以達到發(fā)揮治療作用的有效濃度。HDL是人體內(nèi)體積最小、密度最高的脂蛋白，具有獨特的親水性.疏水性結(jié)構(gòu)、內(nèi)源性可完全降解以及不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別和清除等多種作為藥物載體的特性。以HDL作為藥物載體，可以通過受體介導(dǎo)的機制促進藥物的細胞吸收。在HDL與受體的結(jié)合過程中，HDL的主要蛋白質(zhì)成分apoA-I發(fā)揮關(guān)鍵作用。成熟型apoA-I

17、最顯著的特征是含有8個22個氨基酸和2個11個氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)序列之間被脯氨酸隔開。ApoA-IM和apoA-IParis是apoA-I的天然半胱氨酸突變體，其突變體攜帶者表現(xiàn)為增強的心血管保護活性。ApoA-IM和apoA-IPali。突變位點分別位于螺旋6和螺旋5的雙性α螺旋親、疏水性交界面上，突變位點在多肽鏈位置上恰好相隔22個氨基酸殘基。根據(jù)突變發(fā)生的特殊位置，我們實驗室設(shè)計并構(gòu)建了七種半胱氨酸突變體：A-I(S5

18、2C),A-I(N74C),A-I(K107C),A-I(G129C),A-I(R173C),A-I(K195C)及A-I(S228C)，并對其結(jié)構(gòu)和功能進行了研究。
　　 實驗?zāi)康模?br>　　 本研究利用pET原核表達和純化的重組載脂蛋白apoA-Iwt及7種apoA-I半胱氨酸突變體，流式細胞術(shù)挑選出受體結(jié)合力最高的半胱氨酸突變體apoA-IM用于構(gòu)建藥物載體。通過與10-羥基喜樹堿(HCPT)、普通藥物脂質(zhì)體和rHDL

19、wt-HCPT藥物脂質(zhì)體進行比較，重點觀察rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體對包封藥物體外釋藥、體內(nèi)組織分布和體外抗腫瘤活性的影響，探討rHDLM作為藥物載體對抗腫瘤藥物HCPT水溶性、緩釋作用、組織分布和細胞毒性等的改善作用，進一步探索利用apoA-I突變體或模擬肽作為藥物載體的可行性。
　　 實驗方法：
　　 pET原核表達和純化重組蛋白apoA-Iwt及7種半胱氨酸突變體。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記重組載脂蛋白，流

20、式細胞術(shù)檢測不同部位半胱氨酸突變對apoA-I受體結(jié)合力的影響，選擇受體結(jié)合力增強的apoA-IM突變體制備藥物載體。分別利用apoA-Iwt和apoA-IM重組蛋白，按照不同藥脂比薄膜分散法制備rHDL-HCPT藥物脂質(zhì)體：rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT，并分析不同藥脂比對藥物脂質(zhì)體包封率的影響。按照包封率最高的藥脂比制備藥物脂質(zhì)體，分別利用磷脂測定試劑盒、BCA法和分光光度法檢測藥物脂質(zhì)體內(nèi)的磷脂、蛋白和HCPT藥物的

21、含量，分析藥物脂質(zhì)體內(nèi)的成分組成和有效載藥率。透射電鏡觀察rHDL-HCPT藥物脂質(zhì)體的形態(tài)，軟件計算藥物脂質(zhì)體的平均直徑。采用1％、3％、5％蔗糖和5％、10％、15％每藻糖作為冷凍干燥保護劑，觀察不同凍干保護劑對藥物脂質(zhì)體藥物滲漏和脂質(zhì)過氧化的保護作用。體外釋藥實驗觀察游離HCPT、普通藥物脂質(zhì)體、rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體的體外釋藥曲線。尾靜脈注射10mg/kg游離HCPT和rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)

22、體，靜脈注射后0.5、1、3、5、24小時，摘眼球取血，分離血漿。取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織，稱重后組織勻漿，熒光法檢測血漿和各組織勻漿內(nèi)HCPT藥物含量。利用SKOV-3和HCT-116癌細胞，通過與游離HCPT、普通藥物脂質(zhì)體和rHDLwt-HCPT藥物脂質(zhì)體進行比較，觀察rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體對HCPT細胞毒性的增強作用。
　　 實驗結(jié)果：
　　 受體結(jié)合力分析：與apoA-Iwt相比，apoA

23、-IM突變體的相對受體親和力顯著升高，而A-I(S52C)、A-I(K107C)和A-I(G129C)突變體蛋白的相對受體親和力顯著降低。載脂蛋白A-I(N74C)、A-I(K195C)和A-I(S228C)半胱氨酸突變蛋白的受體親和力未見明顯影響。
　　 藥物脂質(zhì)體的制備：藥脂比為1:20時可以獲得最大藥物包封率。rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體內(nèi)磷脂成分占65.15％，apoA-I成分占30.54％，載藥量達到4.31％。制備

24、完成的rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體顆粒絕大多數(shù)呈圓球形，直徑分別為25.36±10.47mn和22.39±10.25nm，與體內(nèi)天然存在的HDL相似。利用3％蔗糖作為凍干保護劑可以有效保護藥物脂質(zhì)體的藥物滲漏和脂質(zhì)過氧化。體外釋藥實驗：rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體體外釋藥表現(xiàn)為穩(wěn)定緩釋曲線。游離HCPT、普通藥物脂質(zhì)體和rHDLwt-HCPT藥物脂質(zhì)體24小時累積釋藥量分別達到90.7

25、％、65.％和41.3％，而rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體僅有26.9％的藥物釋出。
　　 體內(nèi)組織分布：游離HCPT靜脈注射后藥物主要分布在肝、腎和血漿中，但最高藥物濃度均不超過7μg/g組織。與游離HCPT相比，rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體靜脈注射半小時使肝、腎和脾臟的藥物濃度分別增加5.5、15.4和32.3倍，肺臟和血漿藥物濃度增加1.8倍和1.3倍。游離HCPT靜脈注射5小時后，血漿內(nèi)幾乎檢測不到HCPT存在，而rH

26、DLM-HCPT藥物脂質(zhì)體靜脈注射24小時后，血漿藥物濃度仍維持在0.421μgGHHCPT/ml。同時，rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體靜脈注射24小時后，其肝、腎、脾和肺臟藥物濃度比游離HCPT靜脈注射分別升高2.2-5.7倍。
　　 體外抗腫瘤活性：與游離HCPT相比，普通藥物脂質(zhì)體和rHDLwt-HCPT分別使藥物對SKOV-3細胞的IC50降低27倍和58倍，而rHDLM-HCPT則降低70倍。與游離HCPT和普通藥物脂

27、質(zhì)體相比，rHDLM-HCPT作為藥物載體使HCPT藥物對HCT-116細胞的IC50分別降低50倍和10倍。即使與rHDLwt-HCPT相比，rHDLM-HCPT對HCT-116細胞的IC50仍然降低30％左右。
　　 結(jié)論：
　　 1.ApoA-I不同部位半胱氨酸突變對受體親和力的影響不同。ApoA-IM突變體比apoA-lwt顯著升高的受體親和力使其更適宜于藥物載體的制備。
　　 2.選擇apoA-IM突變

28、體制備藥物載體，薄膜分散法制備rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體。當(dāng)藥脂比為1:20時，rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體的包封率達到最高，載藥率為4.31％。薄膜分散法制備完成的藥物脂質(zhì)體絕大部分呈圓球形，直徑與天然HDL相似。
　　 3.冷凍干燥可以減少藥物脂質(zhì)體內(nèi)藥物滲漏和脂質(zhì)過氧化。利用3％蔗糖作為凍干保護劑可以有效發(fā)揮對藥物脂質(zhì)體的保護作用。
　　 4.rHDLM作為藥物載體使HCPT藥物體外釋藥呈現(xiàn)穩(wěn)定緩釋曲線，其緩

29、釋作用顯著強于游離HCPT、普通藥物脂質(zhì)體和rHDLwt-HCPT藥物脂質(zhì)體。
　　 5.與游離HCPT相比，rHDLM作為藥物載體可以顯著增強HCPT在血漿、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等主要器官的藥物濃度，并且延長藥物濃度的維持時間。
　　 6.rHDLM作為藥物載體可以顯著增強HCPT對SKOV-3卵巢癌細胞和HCT-116結(jié)腸癌細胞的細胞毒性。綜上說述，利用rHDLM作為藥物載體可以顯著改善抗腫瘤藥物HCPT水溶性不足

30、、半衰期短、組織分布特異性和選擇性差的缺陷，并且增強藥物的體外抗腫瘤活性。rHDLM作為藥物載體對藥物物理化學(xué)性質(zhì)和體外抗腫瘤活性的改善作用表明利用apoA-I突變體或模擬肽作為藥物載體的嘗試具有可行性。然而，rHDLM作為藥物載體對抗腫瘤藥物的組織選擇性、藥物濃度維持和抗腫瘤活性的影響還需要進一步在體內(nèi)進行驗證。
　　 第三部分：不同比例載脂蛋白A-I與載脂蛋白A-V重組脂質(zhì)體對其結(jié)構(gòu)和功能的影響
　　 載脂蛋白A-V

31、（apolipoprotein A-V，apoA-V）是2001年通過對人類和小鼠DNA基因組比對分析中偶然發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白家族新成員。ApoA-V轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠研究表明apoA-V具有調(diào)節(jié)血漿TG代謝的功能，與人體內(nèi)TG的代謝和清除密切相關(guān)。ApoA-I是HDL的主要蛋白質(zhì)成分，在膽固醇代謝和抗As中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ApoA-I與apoA-V基因都位于人11號染色體長臂2區(qū)3帶的apoA-I/CIII/AIV/AV基因簇中，此基

32、因簇中表達的多個基因均在膽固醇和甘油三酯代謝過程中發(fā)揮重要作用。盡管apoA-V在體內(nèi)含量很低，大多數(shù)apoA-V在體內(nèi)存在于HDL中，并且可以迅速從HDL向VLDL進行轉(zhuǎn)移。同時，apoA-V在體內(nèi)過表達能夠影響HDL的含量和成熟過程。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)apoA-V蛋白與HDL之間可能存在某種相關(guān)性，apoA-V對HDL結(jié)構(gòu)和功能的影響仍知之甚少。
　　 實驗?zāi)康模?br>　　 原核表達和純化的apoA-V和apoA-I蛋白，

33、利用不同比例的apoA-V和apoA-I重組蛋白，膽酸鈉透析法制備rHDL。通過對rHDL的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及脂質(zhì)結(jié)合能力、體外抗氧化、細胞內(nèi)脂質(zhì)累積、LPL激活和VLDL清除等apoA-I和apoA-V相關(guān)功能的檢測，觀察rHDL內(nèi)不同比例apoA-V對rHDL結(jié)構(gòu)和功能的影響。我們希望對這些問題的研究和揭示能夠?qū)ξ覀兏钊?、更全面的了解apoA-V的功能及作用機制有所幫助。
　　 實驗方法：
　　 利用pET原核表達系統(tǒng)對

34、重組蛋白apoA-lwt進行表達，快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng)對目的蛋白進行純化。原核表達和純化apoA-V重組蛋白，725mM膽酸鈉或50mM檸檬酸鈉溶液(pH3.0)溶解用于后續(xù)實驗。利用不同比例的apoA-V和apoA-I重組蛋白，膽酸鈉透析法制備rHDL。分別利用磷脂測定試劑盒和BCA法檢測重組脂質(zhì)體中磷脂和蛋白含量，分析制備前后重組脂質(zhì)體中磷脂/蛋白比值的改變情況。DMPC濁度澄清實驗分析不同比例apoA-V和apoA-I蛋白混合物

35、的脂質(zhì)結(jié)合能力。透射電鏡觀察負染rHDL的形態(tài)，Image Proplus 6.0軟件計算rHDL的平均直徑。利用體外銅離子介導(dǎo)的LDL氧化系統(tǒng)和TBARS分析法檢測rHDL的體外抗LDL氧化能力；利用THP-1來源的巨噬細胞分析rHDL對oxLDL的巨噬細胞吸收和細胞內(nèi)脂質(zhì)累積的影響；體外LPL激活實驗用于分析rHDL內(nèi)apoA-V對LPL活性的激舌作用；利用HepG2細胞觀察rHDL內(nèi)apoA-V對熒光標(biāo)記VLDL的細胞吸收和清余的

36、影響：利用雄性BALB/c小鼠，體內(nèi)觀察rHDL內(nèi)apoA-V對血漿內(nèi)Dil-VLDL青除的影響；將含apoA-V的rHDL與VLDL在37℃條件下共同孵育30min,密度弟度離心分離VLDL，觀察rHDL內(nèi)apoA-V從rHDL向VLDL的轉(zhuǎn)移。
　　 實驗結(jié)果：
　　 rHDL的制備：原核表達和純化apoA-I和apoA-V蛋白，采用不同比例的apoA-I陽apoA-V重組蛋白，膽酸鈉透析法制備形成六種rHDL:AI

37、-rHDL，AV-rHDL，(1:1)-rHDL，(10:1)-rHDL，(100:1)-rHDL和(1000:1)-rHDL。SDS-PAGE電泳鑒定重組脂質(zhì)體內(nèi)apoA-I和apoA-V的質(zhì)量比與加入初始比例相一致。隨著apoA-V含量的噌加，rHDL內(nèi)磷脂/蛋白比值逐漸升高。DMPC濁度澄清實驗證實apoA-V的脂質(zhì)結(jié)合能力略高于apoA-I。透射電鏡結(jié)果表明隨著rHDL內(nèi)apoA-V含量的增加，rHDL的平均直徑逐漸增大，這可能

38、是由于apoA-V比apoA-I增強的脂質(zhì)結(jié)合能力使apoA-V含量更高的rHDL可以結(jié)合更多的脂質(zhì)，從而導(dǎo)致rHDL體積的增加。
　　 體外抗LDL氧化實驗：隨著rHDL內(nèi)apoA-V含量的增加，rHDL的體外抗氧化活性逐漸增強。為了進一步驗證apoA-V的抗氧化活性，我們在相同量AI-rHDL的基礎(chǔ)上，加入不同量的AV-rHDL，結(jié)果隨著AV-rHDL含量的增加，重組脂質(zhì)體混合物的抗氧化活性逐步增加，表明rHDL內(nèi)apoA-

39、V成分可以增強rHDL的抗氧化活性。脂質(zhì)游離型apoA-V在體外同樣表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性，其抗氧化活性低于脂質(zhì)結(jié)合型。
　　 細胞內(nèi)脂質(zhì)累積實驗：AI-rHDL能夠顯著抑制oxLDL的細胞吸收和細胞內(nèi)月旨質(zhì)累積。然而，隨著rHDL內(nèi)apoA-V含量的升高，THP-1來源的巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)累積顯著增加。
　　 LPL激活實驗：rHDL內(nèi)apoA-V含量的增加不僅沒有增強LPL的水解活性，反而抑制LPL引發(fā)的TG水解作用。將

40、含apoA-V的rHDL與VLDL共同孵育30min后，再加入其它反應(yīng)物質(zhì)進行反應(yīng)，結(jié)果仍沒有增加apoA-V的LPL激活活性。體內(nèi)外VLDL清除實驗：隨著rHDL內(nèi)apoA-V含量的增加，VLDL的細胞吸收和體內(nèi)清除逐漸減少。在給予rHDL之前靜脈注射硫酸魚精蛋白以抑制血漿LPL的活性，結(jié)果在LPL活性被抑制的情況下，血漿內(nèi)VLDL的清除被完全抑制，表明LPL對于VLDL的體內(nèi)清除是至關(guān)重要的。
　　 ApoA-V轉(zhuǎn)移實驗：將

41、含有apoA-V的rHDL與VLDL共同孵育后，VLDL內(nèi)的apoA-V濃度未見明顯升高，表明apoA-V沒有發(fā)生從rHDL向VLDL的轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用不同比例重組apoA-V和apoA-I蛋白，膽酸鈉透析法制備rHDL。由于apoA-V比apoA-I增強的脂質(zhì)結(jié)合能力，制備完成的rHDL隨著apoA-V含量的增加，其磷脂/蛋白比值和直徑逐漸增大。
　　 2.體外抗LDL氧化實驗表明，apoA

42、-V重組蛋白具有抗LDL氧化活性。rHDL內(nèi)apoA-V增強的抗氧化活性可能與apoA-V本身抗氧化功能或apoA-V與apoA-I和磷脂之間的相互作用有關(guān)。
　　 3.ApoA-V和apoA-I重組脂質(zhì)體內(nèi)apoA-V成分對oxLDL的巨噬細胞吸收和細胞內(nèi)脂質(zhì)累積沒有作用，其活性取決于rHDL內(nèi)的apoA-I成分。
　　 4.ApoA-V和apoA-I重組脂質(zhì)體內(nèi)apoA-V體外對LPL活性沒有激活作用。隨著rHDL內(nèi)

43、apoA-V含量的升高，rHDL反而抑制反應(yīng)體系內(nèi)LPL的TG水解活性。
　　 5.在體內(nèi)外VLDL清除實驗中，apoA-V和apoA-I重組脂質(zhì)體內(nèi)apoA-V均未促進VLDL的清除。血漿LPL對于體內(nèi)VLDL的清除至關(guān)重要。
　　 6.在37℃孵育條件下，rHDL內(nèi)的apoA-V不能從rHDL轉(zhuǎn)移至VLDL中。
　　 7.rHDL內(nèi)apoA-V對體外LPL激活和體內(nèi)外VLDL清除的失活，可能是由于rHDL內(nèi)的