人高遷移率族蛋白突變體的制備及其功能的初步研究.pdf

1、嚴重燒傷、創(chuàng)傷可以誘發(fā)機體初期的炎癥反應，但由于機體產生的多種炎癥介質形成的瀑布效應，可以使炎癥反應擴大甚至失去控制，最終導致以細胞自身性破壞為特征的全身性炎癥反應。膿毒癥是由機體過度炎癥反應或炎癥失控所致。膿毒癥、膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征是反映機體內一系列病理生理改變及臨床病情嚴重程度變化的動態(tài)過程，實質是全身炎癥反應綜合征不斷加劇、持續(xù)惡化的結果。糖皮質激素、抗內毒素抗體、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Fact

2、or，TNF)拮抗劑，白介素-1(Interleukin-1β，IL-1)受體拮抗劑等被認為能阻斷這種炎癥“連鎖反應”。但多項臨床實驗證實，抗炎癥治療并沒有達到預期效果。其原因在于大多數致炎因子在發(fā)生炎癥反應的6個小時內即已經釋放并達高峰(這些致炎因子被稱為早期炎癥因子、如TNF、IL-1、IL-6等)，故針對這些早期炎癥因子的臨床治療窗口期相當窄，稍一延遲其治療效果就會大大降低，甚至根本無效。于是，研究者們致力于尋找晚期致炎因子。19

3、99年，Wang等首次報道高遷移率族蛋白(high mobility group box-1protein，HMGB1)可能作為一種晚期炎癥介質參與了膿毒癥的發(fā)病過程。HMGB1是一種在真核細胞中廣泛表達并且高度保守的蛋白。它首先是作為一種DNA結合蛋白而被發(fā)現的，對正常轉錄調節(jié)和基因表達起重要作用的結構因子。研究發(fā)現，HMGB1能被激活的免疫細胞(如巨噬細胞、單核細胞)釋放到細胞外，作為潛在的致炎因子，介導膿毒癥的發(fā)生，而且更有意義的

4、是HMGB1是一種重要的全身炎癥反應晚期炎癥介質。這提示了HMGB1的治療窗口期比其它早期炎癥因子更寬，相對于腫瘤壞死因子(TNF)在受到刺激后數分鐘就產生了，其循環(huán)濃度在疾病進展的頭幾個小時就達到基礎水平，HMGB1在受到刺激后大約20小時后才由巨噬細胞分泌。因此其治療窗口期更寬，使得該分子成為防治全身性炎癥及膿毒癥的措施中極具吸引力一個重要靶標。 目前針對HMGB1的抗炎制劑主要有兩種，抗HMGB1抗體和乙基丙酮酸鹽。然而抗

5、HMGB1抗體在用于人體時，需使用人源化抗體，否則將會導致人抗異源性抗體反應，甚至過敏反應；乙基丙酮酸鹽抑制HMGB1釋放的具體機制尚不清楚，且其大量靜脈應用時的毒性反應還需探討。由此可見，上述兩類HMGB1抑制劑都還有很多不足之處，因此，除了對這兩類抑制劑進行完善外，還需發(fā)展新型HMGB1抑制劑?；谝陨戏治?，本實驗構建了人HMGB1的六個突變體，成功制備并純化了HMGB1蛋白及其六個重組HMGB1突變體蛋白，根據各突變體蛋白與受體結

6、合情況及其致炎效應，篩選出只與受體結合而不能誘發(fā)炎癥反應的突變體并檢測其對HMGB1炎癥效應的競爭性抑制作用。本研究旨在制備并尋找能競爭性抑制HMGB1致炎效應的突變體，為進一步研究和開發(fā)新型抗炎治療候選制劑奠定基礎。 目的： 構建HMGB1的六個突變體，從中篩選出能與靶細胞膜上受體結合但沒有致炎效應的突變體蛋白，并檢測其在體外競爭性抑制HMGB1致炎效應的作用。 材料與方法： 1、人HMGB1的克隆取人

7、新鮮扁桃體組織，按Tripure試劑說明提取總RNA，根據GenBank中編碼人HMGB1的cDNA序列，設計一對特異性引物。按試劑盒說明進行RT-PCR。純化回收RT-PCR產物。將RT-PCR產物連接于pUC18質粒，重組質粒命名為pUC18/HMGB1，然后由上海生工公司進行序列測定。 2、人HMGB1突變體的構建根據突變位點設計六對引物，以重組質粒pUC18/HMGB1為模板，一步反向PCR致突變法構建人HMGB1突變體

8、，重組質粒分別命名為：pUC18/HMGB1 M1，pUC18/HMGB1 M2，pUC18/HMGB1 M3，pUC18/HMGB1 M4，pUC18/HMGB1 M5，pUC18/HMGB1 M6。然后由上海英駿公司進行序列測定。 3、表達載體的構建酶切質粒pUC18/HMGB1、pUC18/HMGB1 M1、pUC18/HMGB1 M2、pUC18/HMGB1 M3、pUC18/HMGB1 M4、pUC18/HMGB1 M

9、5、pUC18/HMGB1 M6，回收目的片斷并連接于原核表達載體pQE-80L。經酶切鑒定得到重組原核表達載體，分別命名為：pQE-80L/HMGB1、pQE-80L/HMGB1 M1、pQE-80L/HMGB1 M2、pQE-80L/HMGB1 M3、pQE-80L/HMGB1 M4、pQE-80L/HMGB1M5、pQE-80L/HMGB1 M6。 4、目的蛋白表達、鑒定將構建的重組表達質粒轉化大腸桿菌DH5α，IPTG誘

10、導蛋白表達，并行SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況。再經蛋白質免疫印跡(WesternBlotting)鑒定表達的目的蛋白。 5、目的蛋白的分離純化收集經IPTG誘導后的細菌，將超聲碎菌離心后的上清過Ni2+-NTA柱純化目的蛋白。 6、激光共聚焦將THP-1細胞作為HMGB1的靶細胞，取生長至對數生長期的THP-1細胞適量分別與純化的M1-M6六種突變體蛋白孵育一定時間，同時加入多粘菌素B排除LPS干擾，設陽性對照(

11、HMGB1蛋白)和陰性對照(PBS)。固定、封閉后依次分別加入一抗稀釋液(羊抗人HMGB1一抗)、FITC標記二抗稀釋液(FITC標記兔抗羊抗體)，置激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞膜上熒光。 7、IL-1β ELISA實驗將生長至對數生長期的適量THP-1細胞共分為8個組：1-6組中分別加入M1-M6六種蛋白，7組為陽性對照(HMGB1蛋白)，8組作為陰性對照(PBS)。每組分別于2h、4h、6h、8h四個時相點收集加入不同蛋白的T

12、HP-1細胞懸液上清，按IL-1β ELISA試劑盒說明書行ELISA。 8、競爭性抑制實驗將生長至對數生長期的適量THP-1細胞分組。除陰性對照組(PBS)，其余各組均加入HMGB1蛋白。再分別加入由IL-1β ELISA實驗篩選得到的只與受體結合而不誘導炎癥因子釋放的突變體蛋白，即HMGB1 M1、M2、M3、M5、M6。分別于2h、4h、6h、8h四個時相點收集各孔中細胞懸液上清，按IL-1β ELISA試劑盒說明書行EL

13、ISA。將篩選出的競爭性抑制作用較強的突變體M1、M2分別行競爭性抑制實驗，收集的樣本行TNF-α ELISA實驗，驗證IL-1β的結果。 結果： 1、經RT-PCR成功克隆了編碼人HMGB1氨基酸的cDNA，片斷長為648bp。經序列比對，與GenBank中報道的已知序列完全一致。 2、以獲得的pUC19/HMGB1為模板，經一步反向PCR法成功構建了HMGB1的六個突變體。經序列測定，與預期設計相符。

14、 3、重組表達質粒pQE-80L/HMGB1、pQE-80L/HMGB1 M1、pQE-80L/HMGB1 M2、pQE-80L/HMGB1 M3、pQE-80L/HMGB1 M4、pQE-80L/HMGB1 M5、pQE-80L/HMGB1M6經酶切后可見648bp大小片斷，酶切結果表明表達質粒構建成功。 4、經IPTG誘導蛋白表達后，SDS-PAGE分析可見，目的蛋白大小約為30kDa。經Western Blotting證實

15、，在30kDa處有明顯蛋白條帶。 5、目的蛋白經Ni<'2+>-NTA柱純化后，純化的蛋白在SDS-PAGE上30kDa處呈現一條帶，證明該目的蛋白得到有效純化。 6、激光共聚焦實驗顯示與陰性對照組相比，分別加入M1-M6六個突變體蛋白的THP-1細胞膜上均可見明顯綠色熒光。說明六種突變體蛋白均能與靶細胞THP-1細胞膜上受體結合。 7、IL-1β ELISA實驗表明六個突變體中，M4組細胞上清中IL-1β含量顯

16、著高于陽性對照組，其余突變體都在某些時相點都低于陽性對照組，因此排除突變體M4。 8、競爭性抑制實驗提示加入HMGB1 M6組在各時相點，其細胞上清中IL-1β含量都明顯高于陽性對照組(HMGB1)；其余各突變體HMGB1 M1、HMGB1 M2、HMGB1M3、HMGB1 M5在2h-6h細胞上清中IL-1β含量與陽性對照組沒有明顯差異(P>0.05)，但在6h-8h均能有效抑制HMGB1誘導IL-1β的表達。其中M2競爭性抑

17、制作用最強，在6h和8h均明顯低于陽性對照組(P<0.05)。將篩選出的競爭性抑制作用較強的M1、M2兩個突變體分別行競爭性抑制實驗后，TNF-αELISA實驗提示，加入M1、M2的兩組TNF-α的含量在各時相點都低于陽性對照，其中M1在8h時THP-1細胞上清中TNF-α的量顯著低于陽性對照組(P<0.05)，M2在6h-8h細胞上清中TNF-α的量顯著低于陽性對照組(P<0.05)。 結論： 本實驗在成功制備、純化H

18、MGB1蛋白及其六個重組HMGB1突變體蛋白的基礎上，通過細胞免疫熒光標記的方法，激光共聚焦顯微鏡篩選出能與THP-1細胞膜上受體結合的突變體，即HMGB1 M1-M6。通過ELISA篩選出能與受體結合卻沒有致炎效應的突變體，即HMGB1 M1、M2、M3、M5、M6。競爭性抑制實驗進一步篩選出能在體外有效競爭性抑制HMGB1致炎效應的突變體，即HMGB1 M1、M2、M3、M5，并得到競爭性抑制作用最強的突變體HMGB1。M2。有望為