高遷移率蛋白A族2在非小細(xì)胞肺癌中作用的研究.pdf

1、本研究分為五部分：
　　 第一部分：高遷移率蛋白A族2在非小細(xì)胞肺癌中的表達及其與細(xì)胞增殖關(guān)系
　　 目的：探討高遷移率蛋白A族2（High Mobility Goup A2 protein，HMGA2)在非小細(xì)胞肺癌中的表達及其與臨床病理因素和細(xì)胞增殖的關(guān)系。
　　 方法：
　　 應(yīng)用免疫組化法檢測38例非小細(xì)胞肺癌（23例鱗癌，15例腺癌）及癌旁的正常肺組織標(biāo)本中HMGA2和Ki-67的表達，并將HM

2、GA2的表達與增殖指標(biāo)Ki-67及其他臨床病理因素進行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：
　　 HMGA2和Ki-67在癌旁的正常肺組織中均不表達，而在肺癌組織中的表達陽性率分別為39.47%、44.74%，二者在肺癌組和癌旁的正常肺組織組之間的表達有顯著性差異 (P＜0.05)。HMGA2的表達在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織明顯高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌者(P＜0.05)，而與其他臨床病理參數(shù)包括腫瘤的分化程度、腫瘤大小和TNM分期以及

3、細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67之間沒有相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 本研究顯示HMGA2在非小細(xì)胞肺癌組織中異常表達，與肺癌的發(fā)生和進展有關(guān)。
　　 第二部分：重組質(zhì)粒pGCsi3.0U6/HMGA2 shRNA的構(gòu)建及其在人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1中的表達
　　 目的：構(gòu)建HMGA2基因短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）的表達質(zhì)粒，并檢測其在人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1中的表達。<

4、br>　　 方法：
　　 設(shè)計并合成有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的HMGA2shRNA對應(yīng)的模板序列，退火并與pGCsi3.0U6/Neo/GFP/RNAi載體重組，經(jīng)測序分析證實重組載體構(gòu)建成功。體外培養(yǎng)SK-MES-1細(xì)胞，分為空白對照組、特異性干擾組和陰性對照組，應(yīng)用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48小時后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達的綠色熒光蛋白。應(yīng)用RT-PCR、Western blot檢測三組細(xì)胞H

5、MGA2的mRNA和蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)測序分析證實重組的pGCsi3.0U6/HMGA2 shRNA質(zhì)粒構(gòu)建成功。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有大量的綠色熒光蛋白，即質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入SK-MES-1細(xì)胞中。與空白對照組比較，特異干擾組和陰性對照組中HMGA2mRNA的表達分別為空白對照組中HMGA2mRNA表達的(48.13±0.15)%和(97.33±0.08)%。與空白對照組比較，特異干擾組和陰性對照組中

6、HMGA2蛋白的表達分別為空白對照組中HMGA2蛋白表達的(42.31±0.05)%和(96.07±0.09)%。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建表達HMGA2shRNA的干擾質(zhì)粒，能夠明顯下調(diào)SK-MES-1細(xì)胞中HMGA2的表達。
　　 第三部分：瞬時轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA沉默HMGA2基因?qū)w外人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1的細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響
　　 目的：研究瞬時轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA沉默HMGA2

7、基因?qū)Ψ西[癌細(xì)胞SK-MES-1的細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并探討可能的機制。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)SK-MES-1細(xì)胞，分為空白對照組、特異性干擾組和陰性對照組，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒。使用MTT法檢測三組細(xì)胞的增殖，流式分析法檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。采用Transwell遷移實驗檢測細(xì)胞的遷移能力，Transwell侵襲實驗則檢測細(xì)胞的侵襲能力。
　　 結(jié)果：
　　 與空白對照組和陰性對照

8、組比較，特異性干擾組中瞬時沉默HMGA2基因的表達導(dǎo)致SK-MES-1細(xì)胞增殖活性顯著下降（P<0.01），并且G1期細(xì)胞的百分比也顯著升高（P＜0.05）。三組細(xì)胞中均沒有檢測到凋亡的峰值（P＞0.05）。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，特異干擾組細(xì)胞穿膜數(shù)為（62.3±6.8），顯著低于空白對照組（151.3±6.5）和陰性對照組（139.7±9.5）（P＜0.01）。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，特異干擾組細(xì)胞穿膜數(shù)為（

9、37.7±3.2），顯著低于空白對照組（84.0±3.6）和陰性對照組（72.3±7.7）（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 瞬時轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA沉默HMGA2基因可以抑制SK-MES-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，但是對細(xì)胞凋亡沒有作用。HMGA2可能參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展，可能作為非小細(xì)胞肺癌治療的理想靶點之一。
　　 第四部分：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA沉默HMGA2基因抑制人肺鱗癌裸鼠移植瘤的生長

10、　　 目的：研究通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染短發(fā)夾的RNA沉默HMGA2基因?qū)θ朔西[癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)SK-MES-1細(xì)胞，分為特異性干擾組和陰性對照組，分別轉(zhuǎn)染pGCsi3.0U6/HMGA2 shRNA質(zhì)粒和pGCsi3.0U6/Neo/GFP/NON RNAi質(zhì)粒。瞬時轉(zhuǎn)染后，經(jīng)過G418篩選形成穩(wěn)定篩選的細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，用Western blot檢測HMGA2

11、蛋白的表達水平。將兩組穩(wěn)定篩選的細(xì)胞制作成細(xì)胞懸液，注射到裸鼠皮下，觀察移植瘤的生長。第5周時處死裸鼠，取下移植瘤瘤塊、稱重，常規(guī)HE染色后顯微鏡下觀察。比較兩組細(xì)胞的移植瘤成瘤率、移植瘤體積和質(zhì)量。
　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)過G418穩(wěn)定篩選的特異性干擾組和陰性對照組細(xì)胞，在熒光顯微鏡下均表達綠色熒光蛋白。特異性干擾組的HMGA2蛋白表達水平是陰性對照組的(41±0.20)%，與陰性對照組相比較，特異性干擾組的HMGA2

12、蛋白表達水平顯著下降，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。特異性干擾組5只裸鼠中有3只發(fā)現(xiàn)有腫瘤生長，成瘤率為60%，而陰性對照組則是5只裸鼠中有4只裸鼠成瘤，成瘤率為80%，兩組細(xì)胞在成瘤率上沒有顯著性差異（P＞0.05）。接種5周后，特異性干擾組和陰性對照組的移植瘤的體積分別為（0.147±0.058）cm3、（0.324±0.069）cm3，質(zhì)量依次為（0.109±0.027）mg和（0.238±0.045）mg。與陰性對照組相比較，特

13、異性干擾組移植瘤體積和質(zhì)量均顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。特異性干擾組和陰性對照組移植瘤組織切片HE染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)均可見到成巢的腫瘤細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 干擾HMGA2表達的短發(fā)夾RNA質(zhì)粒在穩(wěn)定篩選的細(xì)胞中有效地下調(diào)了HMGA2蛋白的表達，并能抑制人肺鱗癌裸鼠皮下移植瘤的生長。
　　 第五部分：Syk在非小細(xì)胞肺癌中的表達及其與臨床病理因素的關(guān)系
　　 目的：探討脾酪氨酸激酶（Sp

14、leen tyrosine kinase，Syk）在非小細(xì)胞肺癌中的表達及其與臨床病理因素和p53的關(guān)系。
　　 方法：
　　 應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測了39非小細(xì)胞肺癌組織（23例肺鱗癌，16例肺腺癌）和癌旁正常肺組織標(biāo)本中Syk和p53蛋白的表達，并將Syk蛋白的表達與臨床病理因素和p53蛋白的表達進行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：
　　 Syk蛋白在非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常肺組織中的表達陽性率分別46.