高遷移率族蛋白B1在重癥急性胰腺炎內(nèi)皮細(xì)胞活化及腸粘膜損害中的作用.pdf

1、重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)死亡率高，預(yù)后差。SAP的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為是一種由多種炎癥介質(zhì)參與，以中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的全身性炎癥反應(yīng)。SAP來勢兇猛，病程進(jìn)展快，死亡率高達(dá)20％-30％。腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官之一，大量研究顯示SAP容易發(fā)生腸屏障功能障礙(intestine barrier functional disturbance，IBFD)，I

2、BFD是SAP并發(fā)感染、甚至形成腹腔膿腫，誘發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、多器官功能障礙綜合征(MODS)，且死亡率居高不下的癥結(jié)所在。
　　 隨著對(duì)SAP發(fā)病機(jī)理研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到SAP時(shí)出現(xiàn)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammation response syndrome，SIRS)及由此引起的多臟器功能衰竭(multiple organ failure，MOF)是SAP高死亡率的主要原因

3、，阻斷SIRS發(fā)生的某一環(huán)節(jié)將有助于減少M(fèi)OF的發(fā)生，降低死亡率。SAP的發(fā)生與大量細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)密切相關(guān)。SIRS是造成多器官功能不全綜合征(MODS)的重要原因。越來越多的證據(jù)表明：SAP時(shí)各種炎性細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子是導(dǎo)致SIRS發(fā)生的關(guān)鍵因素，因此學(xué)者們推測采用細(xì)胞因子抗體或其它拮抗細(xì)胞因子的方法可能會(huì)減輕SAP的炎癥反應(yīng)，后來的實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)了這一結(jié)論，但是治療結(jié)果并不理想。究其原因在于

4、SAP時(shí)SIRS的發(fā)生是通過許多細(xì)胞因子構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的，細(xì)胞因子的數(shù)量眾多且存在互相協(xié)同、互相誘生等多種復(fù)雜的相互作用，因此，單獨(dú)阻斷某一個(gè)或少數(shù)細(xì)胞因子的作用很有限，往往達(dá)不到治療目的。
　　 如何才能有效調(diào)控細(xì)胞因子的產(chǎn)生，阻斷SIRS和MOF的發(fā)生，對(duì)于SAP的防治研究具有重要意義。盡管現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子數(shù)量眾多，但細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)控細(xì)胞因子產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路卻并不多。如能對(duì)關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)

5、行有效的阻斷和調(diào)節(jié)，則可以十分有效地調(diào)控促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而阻斷SIRS和MOF的發(fā)生或減輕其嚴(yán)重程度，進(jìn)而提高治療效果。因此研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在SAP發(fā)病機(jī)制中的作用具有重要意義。
　　 近10余年臨床研究顯示，早期釋放的炎癥因子如TNF-a、IL-1等均在模型建立后迅速升高至峰值，并迅速下降，而此時(shí)炎癥反應(yīng)仍在繼續(xù)，并且臨床應(yīng)用TNF-a、IL-1受體拮抗劑并未取得顯著效果，提示可能存在晚期炎癥介質(zhì)參與病理反應(yīng)。最近研究表

6、明，高遷移率族蛋白-1(high mobility group box1，HMGB1)是相對(duì)于腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1b(I L-1b)新的“晚期”炎癥因子。
　　 高遷移率族蛋白1(high mobility group box1，HM GB1)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非組核蛋白，是一大類高度保守的蛋白質(zhì)，分子量較低(30kDa)，帶電荷氨基酸含量豐富，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移迅速而得名。HMG

7、B1是HMG家族成員之一，既往的研究表明，HMGB1可參與DNA復(fù)制、細(xì)胞分化及基因表達(dá)等多種細(xì)胞生命活動(dòng)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)內(nèi)毒素刺激后，可將HMGB1分泌到細(xì)胞外，介導(dǎo)了內(nèi)毒素的致死效應(yīng)。由于內(nèi)毒素攻擊后HMGB1的產(chǎn)生明顯晚于其他介質(zhì)并持續(xù)時(shí)間較長，故被稱為膿毒癥的“晚期”介質(zhì)。HMGB1通過兩種不同的途徑釋放至細(xì)胞外：活化的單核/巨噬細(xì)胞的主動(dòng)分泌和壞死細(xì)胞的被動(dòng)釋放，同時(shí)存在內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)的兩種不同釋放機(jī)制說明了HMGB1作

8、為內(nèi)源性炎癥介質(zhì)的重要性。與TNF-α和I-1b等早期細(xì)胞因子相比，HMGB1出現(xiàn)較晚且持續(xù)時(shí)間更長，因而可能成為膿毒癥防治切實(shí)可行的潛在干預(yù)目標(biāo)，能給膿毒癥和其他SIRS提供更廣的治療窗。
　　 丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)是一種穩(wěn)定的親脂性丙酮酸衍生物，許多研究表明他具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。我們通過?；悄懰徕c逆行胰膽管內(nèi)注射誘發(fā)大鼠重癥急性胰腺炎模型，觀察丙酮酸乙酯對(duì)相關(guān)炎癥因子的調(diào)節(jié)，探討丙酮酸乙酯對(duì)重

9、癥急性胰腺炎的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 方法
　　 48只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=8)和SAP組(n=40)。SAP組分別于建模后3、6、12、24、48h取材。測定血漿內(nèi)毒素(LPS)、二胺氧化酶(DAO)水平，逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測腸組織高遷移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA表達(dá)，western blot法檢測腸組織HMGB1水平。
　　 結(jié)果<

10、br>　　 與正常對(duì)照組相比，SAP發(fā)病后6h，大鼠血漿中LPS含量與DAO水平即上升，24h達(dá)峰值，48h仍顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。
　　 正常情況下大鼠腸組織中有少量的HMGB1表達(dá)，SAP模型制成6h后，大鼠腸組織中HMGB1表達(dá)開始增高，較對(duì)照組差異顯著(P<0.01)；12h呈現(xiàn)進(jìn)一步升高趨勢，24h達(dá)峰值，至48h仍維持在較高水平。
　　 結(jié)論
　　 1、SAP大鼠腸組織中HMGB1表達(dá)

11、延遲且持續(xù)增高。HMGB1作為晚期炎癥介質(zhì)參與了SAP大鼠腸粘膜屏障損傷的病理生理過程。
　　 2、SAP時(shí)，腸組織內(nèi)HMGB1表達(dá)上調(diào)，腸屏障損傷加重；可通過抑制SAP時(shí)腸組織內(nèi)HMGB1表達(dá)，改善腸屏障功能。
　　 3、逆行胰膽管注射?；悄懰徕c可成功復(fù)制大鼠SAP動(dòng)物模型。
　　 方法
　　 逆行胰膽管注射5％?；悄懰徕c制作SAP模型。雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組、SAP組和EP治療組。

12、測定血漿LPS、D-乳酸含量，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測腸組織HMGB1 mRNA表達(dá)，Western-blot法進(jìn)行HMGB1檢測。通過光學(xué)顯微鏡觀察腸組織病理變化及免疫組織化學(xué)法觀察HMGB1在腸組織中的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 SAP建模后6h，大鼠血漿中LPS含量和D-乳酸含量上升，24h達(dá)峰值，48h仍顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；EP治療后，大鼠血漿LPS含量和D-乳酸含量顯著降低。

13、(P<0.05)。
　　 SAP組大鼠腸組織HMGB1 mRNA表達(dá)水平在SAP后12 h明顯升高，至24 h達(dá)峰，48h仍維持在高水平。EP治療組腸組織HMGB1mRNA表達(dá)水平均明顯低于SAP組(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、SAP時(shí)，HMGB1可介導(dǎo)腸粘膜通透性增加。
　　 2、丙酮酸乙酯能顯著下調(diào)血漿LPS含量和D-乳酸水平并明顯抑制HMGB1基因表達(dá)，改善腸粘膜屏障功能，對(duì)SAP腸粘膜

14、損傷有明顯保護(hù)作用。
　　 方法
　　 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)株ECV-304分為對(duì)照組、HMGB1刺激組、丙酮酸乙酯(EP)處理組，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-a水平變化，免疫熒光顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性的變化，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測RAGE表達(dá)，凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κBDNA結(jié)合活性的變化。
　　 結(jié)果
　　 HMGB1可

15、誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB在短時(shí)間內(nèi)活化，促進(jìn)TNF-a表達(dá)和RAGE表達(dá)上調(diào)；EP處理后可顯著降低NF-κB活性，抑制TNF-a和RAGE表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1、HMGB1可能通過活化血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB進(jìn)而誘導(dǎo)TNF-a分泌，參與膿毒癥的病理生理過程。
　　 2、EP可通過拮抗HMGB1刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活化從而發(fā)揮保護(hù)作用。
　　 3、HMGB1可能部分通過RAGE介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)信