高遷移率族蛋白B1對小鼠調(diào)節(jié)性T細胞免疫功能的影響及機制研究.pdf

1、目的：高遷移率族蛋白Bl(HMGB1)作為一種晚期炎癥介質(zhì)，介導了膿毒癥和其他系統(tǒng)性炎癥的致死性。本實驗擬通過觀察體外刺激小鼠調(diào)節(jié)性T細胞相關指標的表達變化規(guī)律，進而闡明HMGBl對該細胞免疫功能的影響并對其機制進行初步探討。旨在為進一步體內(nèi)實驗及感染后期嚴重膿毒癥的預防和治療提供新思路。 方法：斷頸處死小鼠無菌取脾臟，分離單個核細胞。①采用免疫磁珠法分離獲取正常BALB/c小鼠脾臟CD4+T，CD46CD25-T細胞及CD4+

2、CD25+Treg，鑒定細胞純度。②分別以植物凝集素(PHA)、刀豆素A(ConA)及固相包被抗-CD3這三種不同的刺激劑誘導活化Treg，觀察T淋巴細胞毒性相關抗原4(cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4，CTLA-4)及叉頭翼狀螺旋轉錄因子(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor，F(xiàn)oxp3)表達的時間-效應關系。③將Treg依HMGB1(100ng/

3、ml)刺激時間不同設為24h組、48h組、72h組觀察HMGBl刺激與CTLA-4及Foxp3表達的時間.效應關系。將Treg依HMGBl濃度不同設為0ng/ml組(對照組)、10ng/ml組、100ng/ml組、1000ng/ml組，72h后用流式細胞儀分析CTLA-4、Foxp3表達情況及對IL-10分泌的影響(劑量.效應關系)。④分別提取CD4+CD25+Treg及CD4+CD25-T細胞，設單純CD4+CD25-對照組，另依CD

4、25+：CD25-比例分設1:1組、1:5組、1:10組、1:20組，通過MTT比色試驗檢測CD4+CD25+Treg對CD4+CD25-T細胞抑制的細胞比例關系。⑤HMGBl刺激Treg72h。刺激后細胞依CD25+：CD25-比例設1:1及1:5組。各組分設CD25-組、未刺激Treg組及HMGBl-Treg組。通過MTT比色試驗分析HMGBl刺激對Treg細胞抑制功能的影響。⑥SYBRGREEN法測定HMGBl刺激與Foxp3基因

5、表達的時間、劑量-效應關系。⑦分別留取細胞培養(yǎng)上清，ELISA法測定不同細胞因子的變化情況。 結果：1.小鼠CD4+CD25+Treg純度分析：多次細胞分選實驗證實，正常小鼠脾臟單個核細胞經(jīng)過MACS兩次分選后，CD4+CD25+T細胞純度可達到91.74％～98.14％，其中CD25-細胞低于3％：CD4+CD25-T細胞純度達88.73％～93.85％，其中CD25+細胞少于1％。所獲得的CD4+CD25+T細胞經(jīng)臺盼藍檢測

6、活性大于97％。2.PHA對于CD4+CD25+Treg細胞無明顯活化作用，CTLA-4及Foxp3表達與對照組比較平均熒光強度沒有明顯差異(P＞0.05)。而ConA刺激TregCTLA-4的表達上調(diào)呈一過性，作用持續(xù)時間不超過48h，且對于Foxp3的表達也無明顯的影響?？?CD3則能夠較好地活化Treg，表現(xiàn)為CTLA-4及Foxp3表達在24～72h均明顯增強(P＜0.05或P＜0.01)，其中24、48h表達上調(diào)更為明顯(P＜

7、0.01)，并可延續(xù)至刺激后72h。3.HMGB1刺激Treg，CTLA.4表達在24～72h均有所下降(P＜0.05或P＜0.01)，其中以作用48、72h表達下調(diào)尤為明顯(P＜0.01)；而不同劑量HMGBl(10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml)刺激均可誘導CTLA-4表達下降(P＜0.05或P＜0.01)，其中HMGBl濃度在1000ng/ml時其表達減弱最明顯。Foxp3表達與CTLA-4呈現(xiàn)出相同的趨勢。細胞

8、培養(yǎng)上清中IL-10水平呈現(xiàn)與HMGB1的劑量依賴關系，即HMGBl刺激濃度越高IL-10水平下降越明顯。4.CD4+CD25-T細胞在活化后表現(xiàn)出增殖反應，但隨Treg比例增加，CD4+CD25-T細胞增殖反應抑制。當細胞比例達到1:1時表現(xiàn)為對其抑制效應達到90％左右。當加入HMGBl(1000ng/ml)刺激的Treg時，CD4+CD25-T細胞增殖受抑程度減輕。這～現(xiàn)象在細胞比例為1:1及1:5組均表現(xiàn)出相同的趨勢。5.經(jīng)HMG

9、Bl刺激后的TregFoxp3mRNA表達分別于24～72h明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，其中以作用48、72h后表達下降尤為顯著(P＜0.01)；給予HMGBl刺激72h后，10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的HMGBl刺激均可誘導Foxp3表達減弱(P＜0.0或P＜0.01)，其中HMGBl的濃度在1000ng/ml時Foxp3表達下調(diào)最明顯。6.與正常對照組比較，不同時間及劑量HMGBl體外刺激Treg

10、，其細胞培養(yǎng)上清中IL-2水平均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。而細胞培養(yǎng)上清中IL-10水平隨HMGBl刺激時間延長及濃度增高而下降明顯(P＜0.05或P＜0.01)。將CD4+CD25-T細胞中加入Treg共培養(yǎng)后，CD4+CD25-T細胞上清中IL-2、IFN-γ水平明顯下降，而當加入HMGBl刺激的Treg后，隨HMGBl刺激濃度增加，二者生成受抑制的程度明顯逆轉(P＜0.05或P＜0.01)。與對照組相比，Treg組IL-4/I

11、L-10生成明顯增加，而HMGBl-Treg組IL-4/IL-10水平下降并有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P＜0.01)，且在HMGBl濃度為10ng/ml與100ng/ml時下降更為明顯(P＜0.01)。 結論：1.兩步法免疫磁珠分離CD4+CD25+Treg細胞，所得細胞純度高，細胞活力無影響，完全可以滿足進一步實驗的要求。2.在多種細胞刺激劑中，抗-CD3可以較好地活化Treg，為進一步實驗提供了可能。3.HMGBl可能通過