高遷移率族蛋白B1對燙傷延遲復蘇大鼠T淋巴細胞功能的影響及機制研究.pdf

1、目的：高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為一種晚期炎癥介質，介導了膿毒癥和其他系統(tǒng)性炎癥的致死性。本試驗擬應用大鼠燙傷延遲復蘇模型明確HMGB1在嚴重燙傷中的表達變化規(guī)律，進而闡明HMGB1對細胞免疫功能的影響并對其機制進行初步探討。旨在為燙傷后膿毒癥及多器官功能障礙綜合征的預防和治療提供新思路。 方法：采用30％TBSAⅢ度燙傷后延遲6小時復蘇大鼠模型。雄性Wistar大鼠103只，隨機分為：①正常對照組(n=7)，麻醉后活殺

2、；②假燙傷組(n=32)，分別在假燙傷后1、3、5、7天后活殺；③燙傷組(n=32)，在燙傷后6小時給予林格氏液(40ml/kg)抗休克治療，此外在燙傷后12、24、36、48小時分別給予3ml/次林格氏液腹腔內注射，在相應時間點活殺；④EP液(3.23mg/ml)治療組(n=32)，于燙傷后6小時EP液(40ml/kg)抗休克治療，此外在燙傷后12、24、36、48小時分別給予3ml/次EP液腹腔內注射治療，在相應時間點活殺。無菌取腹

3、主動脈血及脾臟。離心取血漿，應用ELISA分析血漿中IL-2及sIL-2R含量。脾臟分為兩部分：一部分應用RT-PCR檢測HMGB1、IL-2、IL-2R基因的表達及應用凝膠電泳遷移率改變分析法(EMSA)分析活化T-細胞核因子(NFAT)活性。另一部分脾臟用于脾淋巴細胞分離，應用MTT技術分析淋巴細胞增值，應用ELISA分析培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4及IFN-γ含量，應用細胞流式技術檢測脾淋巴細胞白介素2膜受體(mIL-2R)的表達

4、、細胞周期及淋巴細胞的凋亡。 結果：1.燙傷延遲復蘇后HMGB1分泌及mRNA表達規(guī)律：(1)與假燙傷組相比，燙傷1、3、5天血漿HMGB1水平顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。EP治療組1、3、5天血漿HMGB1顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，至燙傷后第7天無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。(2)燙傷組1、3天HMGB1的基因表達量明顯增加，其中燙傷后第一天升高最為顯著(P＜0.01)。但應用EP治療后并沒有降低HM

5、GB1mRNA的表達。2.HMGB1對大鼠脾淋巴細胞增殖、IL-2生成及淋巴細胞功能性極化的影響：(1)在燙傷延遲復蘇后1-7天中，脾淋巴細胞對絲裂原(ConA)刺激的增殖反應明顯受抑制(P＜0.05或P＜0.01)。同時觀察到，在燙傷后1-5天中脾淋巴細胞產生IL-2的能力明顯下降(P＜0.05)。在燙傷早期(1、3天)，脾淋巴細胞表達IL-2R明顯下降(P＜0.05)，但是隨著時間的推移，動物從創(chuàng)傷中逐漸恢復，IL-2R表達逐漸回升

6、至正常范圍。給予EP治療能夠明顯改善燙傷1-7天內脾淋巴細胞對絲裂原刺激的增殖能力(P＜0.05)。同燙傷組比較，EP能夠顯著增加燙傷后1-5天脾淋巴細胞產生IL-2的能力(P＜0.05)。(2)燙傷后1-7天中，血漿sIL-2R水平明顯增加(P＜0.05)，而EP治療對sIL-2R的含量無明顯影響。(3)嚴重燙傷能夠明顯抑制絲裂原刺激所致的細胞周期由G1期向G2+S期轉移，其中在燙傷1、3天尤為明顯(P＜0.05)。應用EP進行干預使

7、得燙傷第1天淋巴細胞由G1期進入G2+S期的細胞比例明顯增加(P＜0.05)。(4)嚴重燙傷后脾淋巴細胞對于絲裂原刺激產生IL-4的能力明顯增加，尤以1、3天為明顯(P＜0.05)。相反，燙傷后3、5、7天與假燙傷組比較，IFN-γ產生的能力明顯下降(P＜0.05)。而EP治療后1、3天脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IL-4含量明顯降低。EP治療1、3、5天能夠明顯增加IFN-γ含量(P＜0.05)。3.HMGB1對大鼠脾T淋巴細胞凋亡、IL-2

8、mRNA表達及信號傳導機制的影響：(1)在燙傷后1天，脾CD3+CD4+T淋巴細胞的凋亡明顯增加(P＜0.05)。給予EP阻斷HMGB1釋放后，能夠明顯降低燙傷后1天脾CD3+CD4+T淋巴細胞的凋亡(P＜0.05)。(2)實驗研究顯示，IL-2mRNA表達在燙傷后1-7天明顯降低(P＜0.05)，而應用EP治療后燙傷1、3天IL-2mRNA表達明顯升高(P＜0.05)。而IL-2RmRNA表達在燙傷及治療組之間無明顯差異(P＞0.05

9、)。(3)燙傷后1、3天的NFAT結合活性顯著降低(P＜0.05)，應用HMGB1抑制劑后能夠明顯提高NFAT的結合活性。 結論：1.燙傷延遲復蘇可以促進HMGB1合成釋放及基因表達，其動力學變化規(guī)律體現(xiàn)了HMGB1產生較晚、下降緩慢的“晚期炎癥介質，，特點。2.燙傷早期HMGB1的過度釋放與脾淋巴細胞增殖反應抑制、IL-2生成減少、IL-2R表達降低及細胞周期由G1期向G2+S期轉移抑制有關，進而證實HMGB1與燙傷早期機體細