中樞拮抗高遷移率族蛋白B1對膿毒癥腦損傷及脾臟樹突狀細胞免疫功能的影響.pdf

1、目的：本研究通過構(gòu)建經(jīng)典膿毒癥動物模型以及側(cè)腦室置管模型，深入探討膿毒癥時腦組織高遷移率族蛋白B1（HMGB1）表達規(guī)律及其與膿毒性腦損傷、樹突狀細胞免疫功能變化的關(guān)系。
　　方法：40只C57BL/6小鼠隨機（隨機數(shù)字法）分為4組:假傷組、膿毒癥組、側(cè)腦室注射假傷組以及膿毒癥動物側(cè)腦室注射HMGB1抑制劑(BoxA)組。采用盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制膿毒癥模型、全自動小鼠腦立體定位儀構(gòu)建側(cè)腦室置管模型，膿毒癥后立即經(jīng)側(cè)腦室導管向側(cè)腦室注射

2、1μg BoxA，于24 h及48 h留取脾臟并通過組織研磨、密度梯度離心、磁性分選的方法分離出樹突狀細胞(DC)及CD4+T細胞，取出整腦并分離出皮層、海馬、丘腦、紋狀體結(jié)構(gòu)。采用組織免疫熒光、蛋白印跡分析(Western blot)、組織TUNEL染色及HE染色方法分別檢測腦組織HMGB1、胱天蛋白酶(caspase)-3表達、組織凋亡、損傷等改變，并采用流式細胞分析術(shù)、細胞計數(shù)檢測法（CCK8法）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分

3、別檢測DC表面分子表達、T細胞增殖活性及細胞因子分泌等變化。
　　結(jié)果：1.膿毒癥組皮層、海馬、丘腦、紋狀體腦組織HMGB1表達較假傷組明顯增加（皮層:P＜0.01;海馬:P＜0.05;丘腦:P＜0.05;紋狀體:P＜0.05）;而膿毒癥24h與48 h相比較各部分組織HMGB1表達無明顯差異。2.膿毒癥組與假傷組比較:皮層、海馬、丘腦、紋狀體組織凋亡細胞數(shù)明顯增加（皮層:P＜0.01;海馬:P＜0.01;丘腦:P＜0.01;紋狀

4、體:P＜0.01），且各腦區(qū)caspase-3表達顯著上調(diào)（皮層:P＜0.05;海馬:P＜0.05;丘腦:P＜0.05;紋狀體:P＜0.05）;各個腦區(qū)組織損傷明顯加重，血清特異性蛋白100β(S100β)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)水平明顯增加(S100β:P＜0.05; NSE:P＜0.05)。而膿毒癥24 h與48 h之間比較，皮層、海馬、丘腦、紋狀體組織細胞凋亡及caspase-3表達、血清S100β和NSE水平均無明顯差異

5、。3.DC表面分子在膿毒癥24 h組較假傷組CD80表達降低（P＜0.05），而CD86、MHC-Ⅱ表達無明顯差異（CD86:P＞0.05;MHC-Ⅱ: P＞0.05），膿毒癥48 h組較假傷組DC表面分子表達均顯著降低(CD80:P＜0.01; CD86: P＜0.05; MHC-Ⅱ: P＜0.01)。4.DC介導T細胞增殖活性在膿毒癥24 h與假傷組比較無明顯差異(P＞0.05)，而在膿毒癥48 h出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05);T細

6、胞分泌IL-2、IFN-γ、 IL-4水平以及IFN-γ/IL-4比值在膿毒癥24h與假傷組比較未見明顯差異，而膿毒癥48 h時IL-2、IFN-γ分泌明顯下降（IL-2:P＜0.01，IFN-γ: P＜0.01），IL-4分泌則增加(P＜0.05)，IFN-γ/IL-4比值刃較假傷組顯著降低(P＜0.05)。5.膿毒癥后側(cè)腦室注射(ICV) BoxA組較膿毒癥組皮層、海馬、丘腦、紋狀體組織HMGB1表達明顯降低（皮層:P＜0.05;海

7、馬:P＜0.05;丘腦:P＜0.05;紋狀體:P＜0.01），側(cè)腦室注射假傷組與膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA組之間其表達無明顯差異，膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA24 h與48 h比較亦無明顯差異。6.膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA組各個腦區(qū)組織細胞凋亡較膿毒癥組顯著減輕（皮層:P＜0.05;海馬:P＜0.05;丘腦:P＜0.05;紋狀體:P＜0.05），caspase-3表達明顯降低（皮層:P＜0.05;海馬:P＜0.05;丘腦:P＜0.05;

8、紋狀體:P＜0.05）。膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA組較膿毒癥組皮層、海馬、丘腦及紋狀體組織損傷明顯減輕，血清S100β和NSE水平亦較膿毒癥組顯著下降(S100β: P＜0.05; NSE:P＜0.05)，但膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA組與側(cè)腦室注射假傷組之間比較、膿毒癥+側(cè)腦室注射24 h與48 h之間比較各個腦區(qū)組織細胞凋亡、caspase-3表達及組織損傷、血清S100β和NSE水平均未見明顯差異。7.膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA組較

9、膿毒癥24 h組CD80表達上調(diào)（P＜0.05），而CD86、MHC-Ⅱ表達沒有明顯差異(CD86: P＞0.05; MHC-Ⅱ:P＞0.05)。與膿毒癥組48 h比較，膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA組CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達明顯上調(diào)（CD80: P＜0.05; CD86:P＜0.05; MHC-Ⅱ: P＜0.05），而膿毒癥假傷組與側(cè)腦室注射假傷組、膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA后24 h與48 h之間DC表面分子表達差異不明顯。8

10、.膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA組DC誘導T細胞增殖能力在48 h時較膿毒癥組明顯增強(P＜0.05)，但24 h與膿毒癥組無明顯差異（P＞0.05）。與膿毒癥組比較，膿毒癥+側(cè)腦室注射BoxA組共培養(yǎng)上清IL-2及IFN-γ水平均顯著升高（IL-2: P＜0.05;IFN-γ:P＜0.05），IL-4分泌量下降(P＜0.05)及IFN-γ/IL-4比值增加(P＜0.05);DC介導T細胞增殖活性、IL-2、IFN-γ、 IL-4水平及IF