膿毒癥時中樞性高遷移率族蛋白B1對外周細(xì)胞免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)與機制的研究.pdf

1、目的：
　　本課題旨在研究膿毒癥時腦組織高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達和膽堿能神經(jīng)活性的變化規(guī)律，進而探討中樞性HMGB1在膿毒癥免疫功能障礙中的作用及其與膽堿能抗炎通路的關(guān)系。
　　方法：
　　1.將40只大鼠隨機分為正常組、假傷組、盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation andpuncture，CLP)24 h組和CLP48 h組。大鼠于CLP術(shù)后24h、48h處死，取出整腦并依次分離皮層、海馬、紋狀體和

2、丘腦。采用蛋白印跡分析(Westernblot)、PCR和組織免疫熒光檢測腦組織HMGB1的表達變化，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測各腦區(qū)膽堿能活性指標(biāo)（AchE、Ach和ChAT）變化。
　　2.將80只大鼠隨機分為正常組、假傷組、HMGB1（1μg）組和HMGB1（10μg）組，分24h、48h兩個時間點，每組10只。各組大鼠分別于側(cè)腦室HMGB1刺激后24h、48h斷頸處死并立即于無菌超凈臺中消毒表面皮膚，無菌取出脾臟

3、，分選出脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、樹突狀細(xì)胞(DC)和CD4+T細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞計數(shù)檢測法（CCK8法）和ELISA法分別檢測Treg和DC表型、T細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞因子分泌的變化。
　　3.將60只大鼠隨機分為正常組、假傷組（Sham+NS）、膿毒癥組(CLP+NS)和膿毒癥+BoxA組(CLP+BoxA)，分24h、48h兩個時間點，每組10只。各組大鼠預(yù)先行側(cè)腦室置管，后分別行假傷或CLP術(shù)后立即給予側(cè)腦室(N

4、S或BoxA)，術(shù)后24h、48h斷頸處死并立即于無菌超凈臺中消毒表面皮膚，無菌取出脾臟，分選出脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、樹突狀細(xì)胞(DC)和CD4+T細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞計數(shù)檢測法（CCK8法）和ELISA法分別檢測Treg和DC表型、T細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞因子分泌的變化。
　　4.實驗分為側(cè)腦室高遷注射和膿毒癥中樞BoxA干預(yù)兩部分。在側(cè)腦室高遷注射實驗中，將16只野生型雄性C56BL/小鼠和16只α7 nAChR敲除

5、雄性C56BL/6小鼠編號、稱重，按隨機原則分別分成對照組和HMGB11微克組，每組8只。在膿毒癥中樞BoxA干預(yù)實驗中，將24只野生型雄性C56BL/小鼠和24只α7nAChR敲除雄性C56BL/6小鼠編號、稱重，按隨機原則分別分成假傷組、CLP組和CLP中樞BoxA干預(yù)組，每組8只。實驗中各組小鼠的處理同前面實驗部分，各組小鼠于術(shù)后24h斷頸處死并立即于無菌超凈臺中消毒表面皮膚，無菌取出脾臟，分選出脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，采用

6、流式細(xì)胞術(shù)、CCK8法和ELISA法分別檢測Treg表型、T細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞因子分泌的變化。
　　結(jié)果：
　　1.膿毒癥組與假傷組比較皮層、海馬、紋狀體、丘腦腦組織HMGB1表達明顯增加（皮層:P＜0.05;海馬:P＜0.05;紋狀體:P＜0.01;丘腦:P＜0.01）;膿毒癥24 h組與膿毒癥48 h相比，各部分組織HMGB1表達無明顯差異。膿毒癥組與假傷組比較各部分腦組織膽堿能活性指標(biāo)明顯增加:AchE（皮層:P＜0.

7、05;海馬:P＜0.05;紋狀體:P＜0.05丘;腦:P＜0.05），Ach（皮層:P＜0.01;海馬:P＜0.01;紋狀體:P＜0.05丘;腦:P＜0.01），ChAT（皮層:P＜0.01;海馬:P＜0.01;紋狀體:P＜0.01丘;腦:P＜0.01）;膿毒癥24 h組與膿毒癥48h相比，各部分組織膽堿能活性指標(biāo)無明顯差異。
　　2.中樞HMGB1對大鼠外周Treg、DC和CD4+T細(xì)胞免疫功能的影響:(1)HMGB11μg組與

8、假傷組比較Treg細(xì)胞Foxp3的表達和IL-10的分泌于48小時增加(P＜0.01-0.05);HMGB110μg組與假傷組比較Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達上調(diào)，對T細(xì)胞增殖抑制功能增強，TGF-β和IL-10分泌增加，各指標(biāo)于24h和48h差異顯著（P均小于0.01）。(2) HMGB11μg組與假傷組比較DC細(xì)胞 CD80、MHCⅡ表達降低，于24和48h差異顯著（P均小于0.05）;HMGB110μg組與假傷組比較D

9、C細(xì)胞CD80、CD86和MHCⅡ表達降低，促T細(xì)胞增殖能力降低，各指標(biāo)于24和48h差異顯著（P均小于0.01）。(3) HMGB11μg組與假傷組比較CD4+T細(xì)胞IFN-γ分泌減少，IL-4分泌增加，各指標(biāo)于24h差異顯著(P均小于0.05);HMGB110μg組與假傷組比較CD4+T細(xì)胞增殖活性減弱，IL-2和IFN-γ分泌減少，IL-4分泌增加，各指標(biāo)于24和48h差異顯著（P均小于0.01）。
　　3.中樞BoxA對膿

10、毒癥大鼠外周Treg、DC和CD4+T細(xì)胞免疫功能的影響:(1)CLP組與假傷組比較Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達上調(diào)，對T細(xì)胞增殖抑制功能增強， TGF-β和IL-10分泌增加，各指標(biāo)于24和48h差異顯著(P均小于0.01);CLP+BoxA組與CLP組比較Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達下調(diào)，對T細(xì)胞增殖抑制功能減弱，TGF-β和IL-10分泌減少，各指標(biāo)于24和48h有差異（P均小于0.01）。(2) CLP組

11、與假傷組比較DC細(xì)胞CD80、CD86和MHCⅡ表達降低，促T細(xì)胞增殖能力減弱，各指標(biāo)于24和48h差異顯著（P均小于0.01）;CLP+BoxA組與CLP組比較DC細(xì)胞CD80、CD86和MHCⅡ表達升高，促T細(xì)胞增殖能力增強，各指標(biāo)于24和48h有差異(P＜0.01-0.05)。(3) CLP組與假傷組比較CD4+T細(xì)胞增殖活性減弱，IL-2和IFN-γ分泌減少，IL-4分泌增加，各指標(biāo)于24和48h差異顯著（P均小于0.01）;C

12、LP+BoxA組與CLP組比較CD4+T細(xì)胞增殖增加，IL-2和IFN-γ分泌增多，IL-4分泌減少，各指標(biāo)于24和48h有差異(P＜0.01-0.05)。
　　4.α7 nAChR在膿毒癥時中樞HMGB1調(diào)節(jié)外周Treg細(xì)胞功能中的作用:(1)在野生型小鼠中，HMGB1刺激組與假傷組比較外周脾Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4上調(diào)，對T細(xì)胞抑制能力增強，TGF-β和IL-10分泌增加（P均小于0.01）;在α7nAChR敲除小

13、鼠中，HMGB1刺激組與假傷組比較外周脾Treg細(xì)胞Foxp3上調(diào)(P＜0.01)，其余指標(biāo)無明顯差異。(2)在野生型小鼠中，CLP+BoxA組與CLP組比較Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達減少，TGF-β和IL-10分泌減少，T細(xì)胞抑制功能減弱(P＜0.01-0.05);在α7 nAChR敲除小鼠中，CLP+BoxA組與CLP組比較Treg細(xì)胞各指標(biāo)差異不明顯。
　　結(jié)論：
　　1.膿毒癥時各腦區(qū)組織HMGB1表達