高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻笫罂莘窦?xì)胞促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的分子機(jī)制.pdf

1、一.研究背景
　　盡管在過去幾十年中,燒傷的預(yù)防,治療及康復(fù)有了長足的進(jìn)步,但全身炎癥反應(yīng)引起的膿毒癥和多器官功能障礙綜合癥依然是重度燒傷患者最重要的死亡原因。作為機(jī)體新陳代謝和免疫反應(yīng)的核心,肝臟被認(rèn)為是啟動重度燒傷病人多器官功能衰竭的重要器官。炎性細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β被證明是燒傷早期最重要的細(xì)胞因子,同時(shí),它們在引起肝細(xì)胞功能障礙過程中也起到重要作用。
　　枯否細(xì)胞(KCS)是一種重度燒傷早期炎癥因子釋放的重

2、要來源。KCs存在于肝血竇中,該部位含有人體內(nèi)存在于固定組織中數(shù)量最龐大的巨噬細(xì)胞。研究表明,KCs在宿主的免疫反應(yīng)引起的系統(tǒng)變化中起到關(guān)鍵作用,其作用表現(xiàn)在引起細(xì)胞因子釋放和上調(diào)。通過早期研究,我們發(fā)現(xiàn)KCs是重度燒傷早期TNF-α和IL-1β釋放的重要來源,并且導(dǎo)致了燒傷后的肝損傷。
　　高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種高度保守的非組蛋白染色體蛋白質(zhì),最初認(rèn)為它是一種參與維護(hù)核小體結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白。但最

3、新研究發(fā)現(xiàn),HMGB1作為一種強(qiáng)有力的促炎性細(xì)胞因子和“晚期”炎癥介質(zhì)參與了全身炎癥反應(yīng)的發(fā)展。此外,人單核細(xì)胞培養(yǎng)純化的重組HMGB1具有顯著刺激細(xì)胞因子(如TNF-α,IL-1α,IL-1β,IL-6和IL-8)釋放的功能。HMGB1不僅可通過損傷和壞死的細(xì)胞被動釋放,還可以通過應(yīng)激狀態(tài)下的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞主動分泌。最新數(shù)據(jù)表明,大面積燒傷患者血漿中HMGB1水平明顯升高。然而,HMGB1在燒傷后KCs釋放促炎性細(xì)胞因子中的作用目

4、前仍未完全闡明。
　　細(xì)胞外HMGB1的生物學(xué)功能通過激活連接到TLR2,TLR4,TLR9和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)。研究表明RAGE在HMGB1引起的巨噬細(xì)胞活化中只起到次要作用,HMGB1主要通過Toll樣受體信號途徑(特別是TLR2和TLR4)起到引起炎癥反應(yīng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)燒傷后大鼠巨噬細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)增加,TLR4缺陷小鼠燒傷后不易發(fā)生肝損傷。
　　二.研究目的
　　基

5、于其在炎癥病理生理過程中的關(guān)鍵作用,HMGB1可能參了燒傷后KCs中炎癥因子的合成調(diào)節(jié)。因此,本研究主要有三個(gè)目的:①探討HMGB1對嚴(yán)重?zé)齻驥Cs的功能影響;②研究嚴(yán)重?zé)齻驢MGB1對KCs作用的受體機(jī)制。是否存在幾種受體的共存?RAGE受體和TLR受體誰起主要作用?③探討嚴(yán)重?zé)齻驢MGB1對KCs作用的受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制?！癕APK和NF-κB信號通路”關(guān)鍵分子是否參與HMGB1調(diào)控?zé)齻驥Cs的活化?
　　三.研究內(nèi)容

6、
　　第一部分高遷移率族蛋白B1對嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs分泌促炎性細(xì)胞因子的影響
　　實(shí)驗(yàn)使用健康成年雄性SD大鼠32只,體重200-250g,購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心。大鼠實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行一周環(huán)境適應(yīng)。大鼠分為A組(燙傷組)及B組(假燙組),A組大鼠(16只)予戊巴比妥(30mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉,剃除背部毛發(fā),大鼠背部置于98℃的熱水中浸潤12秒,獲得總體表面積(TBSA)30％的Ⅲ°燙傷模型(經(jīng)病理切片證實(shí),以下稱燒傷)。燒

7、傷后立即給予每只大鼠腹腔注射乳酸林格氏液(30ml/kg)復(fù)蘇;假燙組(16只)大鼠予同樣的處理,但給予室溫水水浴且不予液體復(fù)蘇。各組大鼠于燒傷或假燙后24h行心臟取血處死。采用肝臟原位灌注、密度梯度離心和選擇性粘附法分離KCs。分別經(jīng)錐蟲藍(lán)染色和乳膠微粒吞噬實(shí)驗(yàn)判斷和鑒定。KCs活性和純度均大于95%以上。分離后的KCs以1×106每孔的密度接種于24孔板中。A、B兩組大鼠KCs各分為4組,分別接受不同濃度HMGB1(0、50、100

8、、200ng/mL)刺激48h。收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液,使用大鼠TNF-α和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國BioSource公司)檢測,相關(guān)操作按照生產(chǎn)商提供的說明書實(shí)行。
　　第二部分RAGE受體在高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs分泌促炎性細(xì)胞因子中的作用
　　健康成年雄性清潔級SD大鼠32只,體質(zhì)量200～250g,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠常溫下飼養(yǎng)1周,20g/L戊巴比妥鈉腹腔注射(30mg/kg)

9、麻醉后,背部置于98℃水中12s,造成30%TBSAⅢ度燙傷(經(jīng)病理切片證實(shí),以下稱燒傷),燒傷后立即給予乳酸林格液腹腔注射(30mL/kg)進(jìn)行液體復(fù)蘇。傷后24h行心臟取血處死大鼠,采用肝臟原位灌注、不連續(xù)密度梯度離心和選擇性粘附法分離KCs。分別經(jīng)錐蟲藍(lán)染色和乳膠微粒吞噬實(shí)驗(yàn)判斷和鑒定。KCs活性和純度均大于95%以上。(1)取部分細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組,各組樣本數(shù)為8:①PBS對照組,加入1mLPBS液培養(yǎng);②HMGB1刺激

10、組,加入1mL濃度為100ng/mLHMGB1刺激。培養(yǎng)48h后行RAGE檢測。(2)另取部分細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組,各組樣本數(shù)為8:①對照組,加入1mLPBS液培養(yǎng);②HMGB1組,加入1mL濃度為100ng/mLHMGB1培養(yǎng);③HMGB1+抗RAGE抗體組,經(jīng)1mL濃度為20μg/mL抗大鼠RAGE單克隆抗體孵育2h后,加入1mL濃度為100ng/mLHMGB1刺激;④HMGB1+重組大鼠RAGE/Fc嵌合體(rrRAGE/F

11、c)組,0.5mL濃度為100ng/mLHMGB1與0.5mL濃度為5μg/mLrrRAGE/Fc孵育2h后,作用于細(xì)胞。培養(yǎng)48h后行TNF-α和IL-1β蛋白和mRNA表達(dá)檢測。
　　第三部分Toll樣受體在高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs分泌促炎性細(xì)胞因子中的作用
　　健康成年雄性清潔級SD大鼠32只,體質(zhì)量200～250g,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠常溫下飼養(yǎng)1周,20g/L戊巴比妥鈉腹腔注射(30m

12、g/kg)麻醉后,背部置于98℃水中12s,造成30%TBSAⅢ度燙傷(經(jīng)病理切片證實(shí),以下稱燒傷),燒傷后立即給予乳酸林格液腹腔注射(30mL/kg)進(jìn)行液體復(fù)蘇。傷后24h行心臟取血處死大鼠,采用肝臟原位灌注、不連續(xù)密度梯度離心和選擇性粘附法分離KCs。分別經(jīng)錐蟲藍(lán)染色和乳膠微粒吞噬實(shí)驗(yàn)判斷和鑒定。KCs活性和純度均大于95%以上。分離后的KCs以每孔1×106個(gè)的密度接種于24孔板中。大鼠的KCs分離后分為四組:⑴對照組,RPMI

13、-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h;⑵HMGB1刺激組,100ng/mlHMGB1刺激48h;⑶HMGB1+抗TLR2抗體組,20μg/ml抗TLR2抗體(美國Invivgen公司)培養(yǎng)2h后加入100ng/mlHMGB1刺激48h;⑷HMGB1+抗TLR4組,20μg/ml抗TLR4抗體(美國Invivgen公司)培養(yǎng)2h后加入100ng/mlHMGB1刺激48h。ELISA法測定KCs上清液中的TNF-α和IL-1β含量。Northern

14、blot法檢測KCs中TNF-α和IL-1βmRNA的表達(dá),Westernblot法檢測KCs中p38及JNK的表達(dá),EMSA法檢測KCs中NF–κB活性。
　　四.研究結(jié)果
　　第一部分
　　來源于對照組和燒傷組大鼠的KCs分別用不同濃度的HMGB1(50-200ng/ml)處理48小時(shí)。運(yùn)用ELISA法檢測上清液中的TNF-α和IL-1β蛋白含量。結(jié)果表明:在正常情況下,KCs僅產(chǎn)生極少基礎(chǔ)量的TNF-α和IL-1

15、β。HMGB1通過劑量依賴的方式刺激KCs分泌TNF-α和IL-1β。此外,在至少給予50ng/ml劑量的HMGB1刺激情況下,燒傷組大鼠KCs產(chǎn)生TNF-α和IL-1β顯著多于對照組。這種差異在使用100ng/ml或者更高濃度HMGB1刺激的實(shí)驗(yàn)組中更為明顯。
　　第二部分
　　培養(yǎng)48h后,HMGB1刺激組KCs表面RAGE表達(dá)水平(1.036±0.101)明顯高于PBS對照組(0.191±0.024,t=-23.158

16、,P=0.000)。培養(yǎng)48h后,與對照組比較,HMGB1組、HMGB1+抗RAGE抗體組和HMGB1+rrRAGE/Fc組KCs培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β含量均顯著增高(P值均小于0.01),后3組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。培養(yǎng)48h后,與對照組比較,HMGB1組、HMGB1+抗RAGE抗體組和HMGB1+rrRAGE/Fc組TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)水平均顯著增高(P值均小于0.01),后

17、3組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。
　　第三部分
　　使用抗TLR2抗體或抗TLR4抗體預(yù)培養(yǎng)KCs都顯著減少了HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β分泌(p<0.01)?？筎LR4抗體較之抗TLR2抗體對HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生具有更強(qiáng)的抑制作用(73%對53%,p<0.05),HMGB1+抗TLR4抗體組KCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平與陰性對照組相似(p>0.05)。同時(shí),TLR2阻斷

18、較之TLR4阻斷更顯著的抑制HMGB1誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生(80%對50%,p<0.05),在HMGB1+抗TLR2組,KCs培養(yǎng)液上清液中的IL-1β水平與無HMGB1刺激的細(xì)胞相似(p>0.05)。
　　同時(shí),KCsRNA的Northernblot分析表明:使用HMGB1刺激48小時(shí)后的KCsTNF-α和IL-1β的mRNA水平顯著增加。此外,經(jīng)過抗TLR2和TLR4預(yù)培養(yǎng)的燒傷后大鼠KCs顯著抑制了HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α

19、和IL-1β的mRNAs表達(dá)(p<0.01)。與對照組相比,給予HMGB1刺激的KCs中,p38的磷酸化明顯增加。抗TLR2和抗TLR4抗體均顯著減少HMGB1刺激引起的p38的磷酸化,分別減少了75%和71%。總p38的表達(dá)各組之間沒有顯著差異。此外,與未接受HMGB1刺激的KCs相比,HMGB1刺激可以顯著上調(diào)KCs中JNK的活性。給予燒傷后大鼠KCs抗TLR2和抗TLR4抗體預(yù)培養(yǎng),可以對JNK的活化起到類似予抑制p38活化的抑制

20、作用。隨著時(shí)間的推移,總JNK的表達(dá)沒有改變。本實(shí)驗(yàn)中,使用EMSA法檢測燒傷大鼠KCs中反射性標(biāo)記的NF-κB結(jié)合序列的核蛋白質(zhì)結(jié)合活性。與對照組相比,100ng/mlHMGB1刺激48h后,NF-κB的活化顯著增加(p<0.01)。這種上調(diào)作用可以被抗TLR2或抗TLR4預(yù)處理大大減弱(p<0.01)。
　　五.研究結(jié)論
　　1.HMGB1以劑量依賴性的方式刺激KCs分泌炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β。燒傷大鼠的KC

21、s對于HMGB1刺激引起的TNF-α和IL-1β表達(dá)比未燙傷大鼠更敏感。
　　2.HMGB1引起燒傷KCs促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放并不主要依賴RAGE。
　　3.HMGB1誘導(dǎo)燒傷后KCs促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生主要是通過Toll樣受體依賴的MAPK/NF-κB信號通路介導(dǎo)。TLR4在HMGB1誘導(dǎo)KCs表達(dá)TNF-α的過程中起到更重要的作用,而HMGB1誘導(dǎo)KCs表達(dá)IL-1β主要依靠TLR2介導(dǎo)。TLR2和TLR4在燒傷后K