高遷移率族蛋白B1促動(dòng)脈粥樣硬化形成及機(jī)制研究.pdf

1、第一章HMGB1促進(jìn)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成
　　研究背景
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是最常見(jiàn)的致死和致殘?jiān)?，主要危險(xiǎn)因素包括血脂代謝紊亂、高血壓、糖尿病、遺傳因素以及不良的生活習(xí)慣等，其形成及進(jìn)展的病理生理機(jī)制涉及炎癥、免疫等多種學(xué)說(shuō)，但具體機(jī)制尚未完全闡明。
　　高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box protein1，HMGB1)是一種非組蛋

2、白染色體結(jié)合蛋白，其主要作用包括作為一種細(xì)胞內(nèi)核蛋白，穩(wěn)定核小體和DNA結(jié)合，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控;同時(shí)HMGB1也可以從壞死細(xì)胞或炎癥細(xì)胞分泌和釋放至細(xì)胞外，如巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與多種炎癥性疾病和危重病的發(fā)生發(fā)展。由壞死細(xì)胞釋放的HMGB1核小體復(fù)合物激活巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6和IL-10; HMGB1本身亦可刺激單核細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞

3、因子;在脈管系統(tǒng)中HMGB1能夠刺激血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，并激活內(nèi)皮細(xì)胞。新近研究發(fā)現(xiàn)HMGB1作為一種炎性細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中扮演著重要角色。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)以細(xì)胞水平的應(yīng)激將As形成的細(xì)胞機(jī)制與炎癥反應(yīng)激活、脂質(zhì)代謝異常、誘導(dǎo)特殊細(xì)胞凋亡等多種危險(xiǎn)因素聯(lián)系起來(lái)，貫徹As發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)將在ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-)模型中研

4、究外源性HMGB1在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，并探討HMGB1的效應(yīng)是否涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。
　　方法
　　采用高脂飼養(yǎng)雄性ApoE-/-小鼠建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。選取24只6周齡雄性ApoE-/-小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分成兩組進(jìn)行飼養(yǎng)，每組12只，同時(shí)選取周齡、性別、體重匹配的C57BL/6J野生型(wild-type，WT)小鼠12只作為正常對(duì)照組:①WT組;②ApoE-/-模型組;③ApoE-/-+HMGB1

5、處理組，其中ApoE-/-+HMGB1處理組小鼠予以尾靜脈注射重組HMGB1(rHMGB1)10 ug/只，每周2次。所有小鼠予以高脂飼料（含膽固醇0.15％，脂肪21％）喂養(yǎng)8周終止實(shí)驗(yàn)，采用心臟穿刺取血收集小鼠血液，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血漿中炎性因子sICAM-1和P-selectin的水平;無(wú)菌條件下取出小鼠胸腹主動(dòng)脈，觀察大體標(biāo)本As病變情況;用蘇丹Ⅳ行脂肪染色;常規(guī)4％多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，行蘇木精-伊紅

6、染色（HE染色）觀察主動(dòng)脈根部As斑塊的組織病理學(xué)特點(diǎn)，計(jì)算As病變面積占主動(dòng)脈內(nèi)膜面總面積的百分比，以評(píng)價(jià)As病變程度;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)主動(dòng)脈弓部As病變中GRP78蛋白的表達(dá)變化，以分析As病變與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果
　　1.與WT對(duì)照組比較，ApoE-/-模型組和ApoE-/-+HMGB1處理組小鼠主動(dòng)脈根部As病變面積百分比明顯增加(P＜0.01)，其中ApoE-/-+HMGB1處理組主動(dòng)脈根部As

7、病變面積較ApoE-/-模型組進(jìn)一步增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);
　　2.與WT對(duì)照組比較，ApoE-/-模型組和ApoE-/-+HMGB1處理組小鼠主動(dòng)脈As病變中GRP78蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，其中ApoE-/-+HMGB1處理組As病變中GRP78蛋白表達(dá)較ApoE-/-模型組進(jìn)一步增加(P＜0.01);
　　3.與WT對(duì)照組比較，ApoE-/-模型組和ApoE-/-+HMGB1處理組小鼠血漿中炎

8、性因子sICAM-1和P-selectin的水平明顯升高(P＜0.01)，其中ApoE-/-+HMGB1處理組血漿中sICAM-1和P-selectin的水平較ApoE-/-模型組進(jìn)一步增加(P＜0.01)。
　　結(jié)論
　　外源性HMGB1具有促動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用，其作用機(jī)制可能與其誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　第二章HMGB1通過(guò)RAGE受體依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　研究背景

9、>　　動(dòng)脈粥樣硬化(As)是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿于As起始、進(jìn)展甚至斑塊破裂血栓形成的全過(guò)程，是斑塊不穩(wěn)定發(fā)生破裂的中心環(huán)節(jié)。As的發(fā)展與內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的促炎性細(xì)胞因子和炎癥趨化因子，如P-selectin、細(xì)胞間粘附分子(intercellularadhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細(xì)胞粘附分子(vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1)有著密切關(guān)系。而這些

10、炎癥因子及粘附分子可通過(guò)活化單核/巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其募集、粘附并浸潤(rùn)至血管內(nèi)膜下，進(jìn)一步促進(jìn)局部炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　許多重要的受體參與了HMGB1信號(hào)通路，包括晚期糖基化終產(chǎn)物受體(the receptor for advanced glycation end products，RAGE)及toll樣家族受體(toll-like family of receptors，TLRs)。HMGB1通過(guò)RAGE或TLRs活化核因

11、子-kB(nuclear factor-kB，NF-kB)發(fā)揮作用，從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的生成、白細(xì)胞粘附分子的上調(diào)，導(dǎo)致組織損傷及炎癥反應(yīng)。
　　基于我們第一部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明外源性HMGB1具有促動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用，其作用機(jī)制可能與其誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究將在原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），探討外源性HMGB1是否通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成;進(jìn)一步探討在內(nèi)皮細(xì)胞炎

12、癥反應(yīng)中HMGB1是否通過(guò)RAGE受體激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　方法
　　1.HMGB1濃度實(shí)驗(yàn):采用不同濃度的HMGB1(0、0.01、0.1、1和10μg/ml)孵育原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)24小時(shí)，用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)HUVECs中PERK和IRE1蛋白的表達(dá)，以明確HMGB1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的最佳濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);選擇1μg/ml的HMGB1孵育HUVECs24小時(shí)，

13、采用免疫熒光法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞ATF6核轉(zhuǎn)移情況。
　　2.PERK、IRE1小分子RNA干擾(siRNA)實(shí)驗(yàn):當(dāng)HUVECs達(dá)到60％～70％融合后，采用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑分別將PERK或IRE1 siRNA干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，干擾PERK或IRE1表達(dá)，real-time PCR或Western Blot檢測(cè)PERK或IRE1 mRNA或蛋白的表達(dá)評(píng)價(jià)不同片段轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳片段的合適濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PERK或IR

14、E1 siRNA干擾24 h后用HMGB1(1μg/ml)孵育HUVECs24小時(shí)，Western Blot法檢測(cè)HUVECs中ICAM和P-selectin蛋白的表達(dá)，并用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中sICAM和P-selectin的水平。
　　3.eIF2α、JNK抑制實(shí)驗(yàn):分別采用eIF2α抑制劑Salubrinal(100μM)、JNK抑制劑SP60012（10μM）預(yù)孵育HUVECs30 min后用HMGB1(1μg/m

15、l)孵育HUVECs24小時(shí)，Western Blot法檢測(cè)HUVECs中ICAM和P-selectin蛋白的表達(dá)，并用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中sICAM和P-selectin的水平。
　　4.RAGE抗體中和實(shí)驗(yàn):采用RAGE抗體(20μg/ml)預(yù)孵育HUVECs30 min后用HMGB1(1μg/ml)孵育HUVECs24小時(shí)，Western Blot檢測(cè)HUVECs中PERK、eIF2α、p-eIF2α、IRE1、JN

16、K蛋白的表達(dá)，并用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中sICAM和P-selectin的水平。
　　結(jié)果
　　1.外源性HMGB1處理使原代HUVECs中PERK和IRE1蛋白的表達(dá)增加，同時(shí)也促進(jìn)ATF6核轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其中以1μg/ml處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h最為明顯。
　　2.外源性HMGB1處理使原代HUVECs中ICAM和P-selectin的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。
　　3.抑制P

17、ERK或IRE1表達(dá)，或選擇性抑制eIF2α或JNK后可顯著逆轉(zhuǎn)外源性HMGB1處理引起的ICAM和P-selectin表達(dá)的上調(diào)(P＜0.01)，減輕炎癥反應(yīng)的程度。
　　4.外源性HMGB1處理使原代HUVECs中PERK、p-eIF2α、IRE1、JNK蛋白的表達(dá)顯著上調(diào);特異性抗體中和RAGE效應(yīng)后，可顯著逆轉(zhuǎn)外源性HMGB1處理引起的PERK、p-eIF2α、IRE1、JNK蛋白的表達(dá)上調(diào)，以及sICAM和P-selec