PCSK9在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9（proprotein convrtase subtilisin/kexin9，PCSK9）是2003年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)蛋白，屬于前蛋白酶家族中的第九個(gè)成員。研究表明 PCSK9可通過促進(jìn)肝細(xì)胞的低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)降解，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，影響血漿LDL-C水平。 PCSK9已經(jīng)成為降脂藥物研發(fā)及動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosi

2、s，As)干預(yù)的熱門靶點(diǎn)。目前研究主要是闡明了PCSK9通過調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝從而影響血脂，間接參與As發(fā)生。但是，有研究認(rèn)為除了影響血液LDL-C水平之外，PCSK9對血管壁的直接作用在As發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮重要影響。因此有必要闡明PCSK9在血管壁如何直接參與As發(fā)生及其機(jī)制，為揭示PCSK9在As發(fā)病中的作用及機(jī)制提供新觀點(diǎn)，并為確立PCSK9作為As治療新靶點(diǎn)提供更充分的科學(xué)依據(jù)。
　　血管壁巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積及炎癥反應(yīng)作為

3、As發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)已得到廣泛認(rèn)同，抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)是干預(yù) As形成的一個(gè)重要方向。巨噬細(xì)胞主要是通過清道夫受體途徑荷脂，這種方式不受細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，因此可無限制地?cái)z入 ox-LDL并沉積在胞內(nèi)，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成，進(jìn)而促進(jìn)As斑塊的發(fā)展。但PCSK9在巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的作用及機(jī)制尚待闡明。
　　2010年Lan H等通過基因微陣列分析研究發(fā)現(xiàn)炎癥和應(yīng)激反應(yīng)途徑可能受PCSK9的調(diào)控。而我們的前期

4、工作發(fā)現(xiàn)在冠心病患者血漿中PCSK9水平與IL-6、TNF-α水平均呈正相關(guān)。巨噬細(xì)胞作為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的主要炎癥細(xì)胞，可分泌大量的炎性因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)，從而導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定性，加速斑塊的破裂。但PCSK9是否參與巨噬細(xì)胞的炎癥因子分泌目前尚不清楚。
　　因此，本研究提出“PCSK9通過參與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌而促進(jìn) As發(fā)生發(fā)展”的科學(xué)

5、假設(shè)。為回答這一科學(xué)問題，在第一部分研究中檢測了PCSK9在As斑塊中的表達(dá)情況以及是否與巨噬細(xì)胞共定位，并觀察了氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）對巨噬細(xì)胞PCSK9表達(dá)的影響；在第二部分研究中，通過構(gòu)建 PCSK9過表達(dá)慢病毒載體和PCSK9-shRNA慢病毒載體，上調(diào)或抑制巨噬細(xì)胞 PCSK9表達(dá)，觀察 PCSK9表達(dá)改變對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響，并探索此

6、過程中脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的變化；在第三部分研究中，采用ApoE-/-小鼠，通過尾靜脈注射PCSK9-shRNA慢病毒載體，并高脂喂養(yǎng)復(fù)制As動(dòng)物模型，在此基礎(chǔ)上觀察了PCSK9-shRNA對ApoE-/-小鼠As病變及其斑塊脂質(zhì)蓄積和局部炎癥的影響，并探討了CD36和TLR4/NF-κB信號(hào)通路在此過程中的作用。
　　第一部分，PCSK9在As斑塊巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及oxLDL對巨噬細(xì)胞PCSK9表達(dá)的影響
　　目

7、的：明確PCSK9在As斑塊中是否表達(dá)及與巨噬細(xì)胞共定位情況；分析oxLDL對巨噬細(xì)胞PCSK9表達(dá)的影響。
　　方法：取尸檢的人As斑塊以及ApoE-/-小鼠As斑塊，采用免疫組織化學(xué)法檢測斑塊中PCSK9的表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測PCSK9在斑塊中與巨噬細(xì)胞共定位情況；培養(yǎng)人 THP-1巨噬細(xì)胞和小鼠 RAW264.7巨噬細(xì)胞，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測PCSK9在兩種巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況；最后，用不同濃度ox-LDL處理

8、兩種巨噬細(xì)胞不同時(shí)間，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測細(xì)胞PCSK9 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示As斑塊中PCSK9呈陽性表達(dá)，陽性染色的區(qū)域主要分布在斑塊增生的內(nèi)膜中，而在正常主動(dòng)脈中未見PCSK9明顯表達(dá)；免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測結(jié)果顯示 As斑塊中PCSK9陽性表達(dá)區(qū)域與巨噬細(xì)胞特異性抗原CD68陽性表達(dá)區(qū)域基本一致；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示，PCSK9在人THP-1

9、巨噬細(xì)胞和小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞均陽性表達(dá)，呈紅色熒光，主要分布在細(xì)胞胞漿中；實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示， oxLDL呈濃度依賴性上調(diào)兩種巨噬細(xì)胞PCSK9 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，而50μg/ml oxLDL分別處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間后，PCSK9 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)也上調(diào)，呈時(shí)間依賴性。
　　小結(jié)：① PCSK9在As斑塊中存在表達(dá)且與巨噬細(xì)胞共定位；②巨噬細(xì)胞中存在PCSK9表達(dá)，oxLDL

10、呈濃度和時(shí)間依賴性上調(diào)巨噬細(xì)胞中PCSK9表達(dá)。
　　第二部分，PCSK9對oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響及機(jī)制
　　目的：觀察PCSK9表達(dá)改變對oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響及其調(diào)控分子機(jī)制。
　　方法：1.根據(jù)設(shè)計(jì)的PCSK9基因 RNA干擾靶序列，合成靶序列的雙鏈DNA，接入GV115慢病毒載體，構(gòu)建PCSK9-shRNA慢病毒載體；利用PCR方法獲得小鼠PCSK9基

11、因，并將其連接入GV287慢病毒載體，構(gòu)建PCSK9過表達(dá)慢病毒載體；采用菌落 PCR和DNA測序?qū)?gòu)建的載體進(jìn)行鑒定后，分別與pHelper1.0載體和pHelper2.0載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒，采用熒光法或?qū)崟r(shí)定量 PCR測定病毒滴度；兩種慢病毒顆粒分別感染體外培養(yǎng)的小鼠 RAW264.7巨噬細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量 PCR和/或 Western blotting檢測細(xì)胞PCSK9表達(dá)。2.以PCSK9-shRNA慢病毒

12、載體、PCSK9過表達(dá)慢病毒載體和/或oxLDL處理RAW264.7巨噬細(xì)胞，油紅O染色、Filipin染色法檢測巨噬細(xì)胞膽固醇蓄積， ELISA檢測細(xì)胞炎癥因子分泌。3.以PCSK9-shRNA慢病毒載體、PCSK9過表達(dá)慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞，加或不加oxLDL處理，采用實(shí)時(shí)定量PCR或Western blotting檢測巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36、SR-AI、SR-BI和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因TLR4表達(dá)以及NF-κ

13、B活性。
　　結(jié)果：1.菌落PCR和DNA測序證實(shí)，PCSK9-shRNA慢病毒載體和PCSK9過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建正確，病毒滴度分別為5.0×108 TU/ml和2.0×108 TU/ml；實(shí)時(shí)定量PCR和/或Western blotting結(jié)果顯示，PCSK9-shRNA慢病毒明顯抑制了RAW264.7巨噬細(xì)胞 PCSK9表達(dá)，而 PCSK9過表達(dá)慢病毒大幅度增加了RAW264.7巨噬細(xì)胞 PCSK9表達(dá)。2.油紅 O染色和F

14、ilipin染色結(jié)果顯示，與oxLDL單獨(dú)處理組相比，PCSK9低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積明顯減少，而PCSK9過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積則明顯增多；ELISA檢測結(jié)果顯示PCSK9低表達(dá)能抑制oxLDL誘導(dǎo)的RAW264.巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1分泌，而PCSK9過表達(dá)能促進(jìn)oxLDL誘導(dǎo)的RAW264.巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌。3.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，PCSK9低表達(dá)或過表達(dá)對巨噬細(xì)胞SR-AI、SR

15、-BI mRNA表達(dá)均無影響，而CD36和TLR4 mRNA表達(dá)在PCSK9干擾時(shí)下調(diào)，在PCSK9過表達(dá)時(shí)上調(diào)；Western blotting結(jié)果顯示，PCSK9低表達(dá)及過表達(dá)對oxLDL誘導(dǎo)的RAW264.巨噬細(xì)胞SR-AI和SR-BI蛋白質(zhì)表達(dá)的改變無明顯的影響，但PCSK9低表達(dá)能抑制oxLDL誘導(dǎo)的RAW264.巨噬細(xì)胞CD36、TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)的上調(diào)，而PCSK9過表達(dá)能加劇這一效應(yīng)，結(jié)果還顯示，PCSK9低表達(dá)可以抑制

16、oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞p-IkBα表達(dá)上調(diào)、IkBα的降解以及NF-κB核轉(zhuǎn)位，而PCSK9過表達(dá)的作用則與其相反。
　　小結(jié)：①成功構(gòu)建PCSK9過表達(dá)和干擾慢病毒載體；② PCSK9高表達(dá)能促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌，PCSK9低表達(dá)則起抑制作用；③PCSK9促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌與其上調(diào) CD36表達(dá)以及激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。
　　第三部分，LV-PCSK9 shRNA對apoE-

17、/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脂質(zhì)蓄積和局部炎癥因子表達(dá)的影響及機(jī)制研究
　　目的：探索LV-PCSK9shRNA對ApoE-/-小鼠As斑塊脂質(zhì)蓄積和局部炎癥因子表達(dá)的影響及其機(jī)制。
　　方法：6周齡雄性ApoE-/-小鼠30只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組：對照組、LV-PCSK9 shRNA組，每組15只，其中LV-PCSK9 shRNA組通過尾靜脈注射LV-PCSK9 shRNA，每只鼠注射量為4×107TU/次，每6周一

18、次。兩組小鼠予以高脂喂養(yǎng)，12周后處死動(dòng)物，采用熒光顯微鏡觀察LV-PCSK9 shRNA轉(zhuǎn)染情況；分別采用免疫組織化學(xué)法、實(shí)時(shí)定量PCR及Western blotting檢測主動(dòng)脈PCSK9基因表達(dá)情況；全自動(dòng)生化分析儀檢測各組小鼠血脂水平；體視顯微鏡下觀察、蘇丹Ⅳ染色及HE染色檢測主動(dòng)脈粥樣硬化病變面積；油紅O染色、Masson染色以及Filipin染色三種方法檢測主動(dòng)脈竇As病變處脂質(zhì)蓄積的情況；免疫熒光和免疫組織化學(xué)法檢測斑塊巨

19、噬細(xì)胞浸潤情況；實(shí)時(shí)定量 PCR和免疫組織化學(xué)法檢測主動(dòng)脈TNF-α、IL-1β和MCP-1的表達(dá)；免疫組織化學(xué)或熒光法、實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測主動(dòng)脈CD36、TLR4及NF-κB的表達(dá)。
　　結(jié)果：熒光顯微鏡觀察顯示主動(dòng)脈存在GFP表達(dá)；LV-PCSK9 shRNA成功敲減了ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈中PCSK9基因的表達(dá)；與對照組相比， LV-PCSK9 shRNA組ApoE-/-小鼠血脂水平無明顯

20、改變，但主動(dòng)脈粥樣硬化病變面積明顯減少；油紅O染色、Masson染色以及Filipin染色分析結(jié)果顯示LV-PCSK9 shRNA可減少 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇 As病變處脂質(zhì)蓄積；與對照組相比，LV-PCSK9 shRNA組主動(dòng)脈炎癥因子TNF-α、IL-1β和MCP-1 mRNA的表達(dá)以及主動(dòng)脈竇As斑塊處TNF-α、IL-1β和MCP-1蛋白質(zhì)的分泌減少，并且主動(dòng)脈竇As斑塊中巨噬細(xì)胞浸潤減少，而免疫組織化學(xué)法、實(shí)時(shí)定量PCR