新的細(xì)胞亞群Th17在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用.pdf

1、目的： 動(dòng)脈粥樣硬化引起的急性冠狀動(dòng)脈綜合癥已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國中老年人健康的常見疾病，并有逐年遞增趨勢，但由于其發(fā)病機(jī)制尚不清楚對其防治帶來困難。近年來研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一種自身免疫病，多種免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞）和細(xì)胞因子參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展，特別是CD4+T細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用引起了關(guān)注。CD4+T細(xì)胞是一類異源性群體，受抗原刺激后在不同的細(xì)胞因子作用下可分化為不同的亞群，包括傳統(tǒng)的Th1和Th2，以及新近

2、發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryT cells，Treg）。目前，不同CD4+T細(xì)胞亞群在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用尚不清楚。有資料顯示Th1具有促進(jìn)斑塊形成的作用，Th2在斑塊形成中的作用尚存在爭議。近年來，有兩個(gè)研究小組認(rèn)為CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中起到保護(hù)性的作用，但Th17在動(dòng)脈粥硬化斑塊中的作用尚不清楚。 Th17是以分泌IL-17為主要特征的CD4+T細(xì)胞群體，在體外

3、，CD4+初始T細(xì)胞受抗原刺激后在IL-6和TGF-β的作用下可以促使Th0分化成為Th17細(xì)胞，控制其分化的轉(zhuǎn)錄因子是RORγt。目前研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。 為了明確T細(xì)胞亞群與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以及Th17細(xì)胞亞群對動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響，本論文從以下四個(gè)方面進(jìn)行了研究： 一、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型的建立及斑塊的形成過程； 二、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成發(fā)生過程中

4、不同Th亞群的變化； 三、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成發(fā)生過程中相關(guān)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的變化； 四、Th17/IL-17在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的確切作用。 方法： 一、動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的建立 1.ApoE-/-小鼠8周開始給予高脂飼料喂養(yǎng)，10周行左側(cè)頸動(dòng)脈套管縮窄手術(shù)（加速斑塊的形成），然后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)分別至16和24周。 2.取不同周齡小鼠左側(cè)頸動(dòng)脈制備連續(xù)冰凍切片，HE染色和油紅O染色檢

5、測不同周齡小鼠頸動(dòng)脈斑塊形成情況和斑塊局部脂質(zhì)沉積情況。 3.RT-PCR檢測斑塊局部相關(guān)炎性因子的表達(dá)情況。 二、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生過程中Th1，Th17和Treg細(xì)胞的變化規(guī)律 1.分別取未形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期和晚期小鼠的脾臟制備脾細(xì)胞懸液，進(jìn)行多種標(biāo)記。 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟中Th1，Th17和Treg細(xì)胞的比例變化。 三、斑塊局部相關(guān)炎性因子和轉(zhuǎn)錄因子的檢測

6、 1.分別取未形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期和晚期小鼠的頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈弓。 2.RT-PCR檢測小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部相關(guān)炎性因子（IFN-γ、IL-17）和轉(zhuǎn)錄因子（T-bet、RORγt）的表達(dá)情況。 四、IL-17產(chǎn)生細(xì)胞對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響 1.ApoE-/-小鼠20只，隨機(jī)分成兩組，8周開始給予高脂飼料喂養(yǎng)，10周行左側(cè)頸動(dòng)脈套管縮窄手術(shù)。 2.套管5天后給ApoE-/

7、-小鼠腹腔注射中和性IL-17抗體，對照組同時(shí)腹腔注射同型對照。 3.微型活體超聲檢測頸動(dòng)脈形成的斑塊大小。 4.取小鼠左側(cè)頸動(dòng)脈制備連續(xù)冰凍切片，HE染色和油紅O染色檢測小鼠頸動(dòng)脈斑塊的大小。 結(jié)果： 一、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型的建立及斑塊的形成過程 （一）頸動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成 為了研究不同T細(xì)胞亞群在粥樣硬化斑塊形成中的作用，我們首先利用ApoE-/-小鼠建立了快速頸動(dòng)脈粥樣硬化斑

8、塊模型。ApoE-/-小鼠從8周開始給予高脂飼料喂養(yǎng)，10周給予頸動(dòng)脈套管加速斑塊的形成，至小鼠16周和24周后，處死小鼠取頸動(dòng)脈制備冰凍切片并進(jìn)行HE染色和油紅O染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-模型小鼠8周時(shí)，血管壁僅出現(xiàn)增厚但沒有斑塊的形成：到達(dá)16周時(shí)，血管內(nèi)膜有明顯的斑塊形成，此時(shí)，斑塊纖維帽較厚，浸潤的細(xì)胞較多，平滑肌細(xì)胞明顯增多，含有大量的膠原成分和脂質(zhì)，屬于纖維斑塊期，即早期斑塊；到達(dá)24周時(shí)，斑塊的纖維帽明顯變薄，膠原和平

9、滑肌細(xì)胞減少，脂質(zhì)含量明顯增多，為粥樣斑塊期，即晚期斑塊。同齡的野生型C57BL/6細(xì)胞在整個(gè)觀察過程中沒有斑塊形成。 （二）斑塊局部粘附分子和細(xì)胞因子的變化 為了證實(shí)斑塊中有炎性免疫反應(yīng)的存在，我們用RT-PCR的方法檢測了已經(jīng)形成斑塊的主動(dòng)脈弓和頸動(dòng)脈中相關(guān)粘附分子和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管粘附分子-1（VCAM-1）以及IL-12和TNF-α在斑塊形成后表達(dá)明顯升高。 二、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成發(fā)

10、生過程中不同Th亞群的變化 （一）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）在斑塊形成過程中的變化 為了研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞隨動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的變化規(guī)律，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了8周、16周、24周小鼠脾細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+Foxp3+T細(xì)胞從未形成斑塊到形成斑塊的整個(gè)過程中均高于對照組，其中主要是CD4+ Foxp3+ CD25-T細(xì)胞亞群升高，而CD4+ Foxp3+ CD25+T細(xì)胞無明顯的變化。此外，我們還發(fā)

11、現(xiàn)無論是ApoE-/-模型小鼠還是C57BL/6正常小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例均隨年齡的增長呈現(xiàn)下降的趨勢，而CD4+CD25-Foxp3+T細(xì)胞的比例呈明顯上升的趨勢。提示這兩群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群在動(dòng)脈粥樣硬化和衰老中扮演著不同角色，但具體作用有待進(jìn)一步研究（已經(jīng)獲得國家自然基金資助） （二）Th1和Th17細(xì)胞在斑塊形成過程中的變化 為了研究Th17細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣斑塊形成過程中的作用以及與Th1

12、細(xì)胞的關(guān)系，我們分別取無斑塊（8周）、早期斑塊（16周）和晚期斑塊（24周）小鼠的脾臟制備脾細(xì)胞懸液，采用胞內(nèi)流式細(xì)胞染色方法檢測Th1（CD4+IFN-γ+T）細(xì)胞和Th17（CD4+IL-17+T）細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在無斑塊形成時(shí)，Th1和Th17數(shù)量較同齡的野生型小鼠無明顯改變，當(dāng)小鼠有斑塊形成時(shí)（16周和24周），Th1和Th17細(xì)胞的比例較對照組均明顯升高，且與斑塊的大小呈正比，提示Th17細(xì)胞與Th1細(xì)胞均參與動(dòng)脈粥樣斑塊

13、的形成。 三、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成過程中相關(guān)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的變化 為了進(jìn)一步證實(shí)Th1和Th17細(xì)胞確實(shí)存在在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部發(fā)揮作用，分別取無斑塊（8周）、早期斑塊（16周）和晚期斑塊（24周）小鼠的頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈弓部抽提RNA，采用RT-PCR的方法檢測RORγt、T-bet和IFN-γ、IL-17在斑塊中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子在斑塊形成早期和晚期的表達(dá)均較對照組明顯升高；另外，在ApoE-/-

14、小鼠16周時(shí)IFN-γ和IL-17的表達(dá)均明顯上調(diào)，而在斑塊形成的晚期則表達(dá)降低，進(jìn)一步證實(shí)了Th1和Th17細(xì)胞均參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。 四、Th17/IL-17在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的確切作用 IL-17是Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，為了證實(shí)Th17細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的作用，我們給ApoE-/-模型小鼠腹腔注射抗IL-17的中和性抗體用以中和IL-17的作用，進(jìn)一步采用小鼠微超聲成像和病理學(xué)方法觀察抗體

15、干預(yù)對斑塊形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)9只對照組小鼠左側(cè)頸動(dòng)脈均有較大斑塊的形成，而小鼠體內(nèi)注射中和性IL-17抗體組，10只小鼠中僅有一只出現(xiàn)了較小的斑塊，其他小鼠幾乎沒有斑塊的形成，這就說明產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用，以此為靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)對動(dòng)脈粥樣硬化的治療有重要價(jià)值。 結(jié)論： 1.不同Th亞群在動(dòng)脈斑塊的形成過程中均發(fā)生了改變 （1）CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）在斑

16、塊形成過程中比例上調(diào)，其中主要是CD4+ Foxp3+ CD25-T細(xì)胞亞群升高，而CD4+ Foxp3+ CD25+T細(xì)胞無明顯的變化，提出CD4+ Foxp3+ CD25-T細(xì)胞亞群可能具有正向調(diào)節(jié)作用，但具體作用有待進(jìn)一步研究。（已經(jīng)獲得國家自然基金資助） （2）Th1和Th17細(xì)胞在斑塊形成后明顯升高，且與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的大小成正比，另外，斑塊局部Th1和Th17相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子升高，提示Th17和Th1細(xì)胞均參

17、與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成。 2.用中和抗體阻斷Th17的主要效應(yīng)分子IL-17的作用可明顯抑制斑塊的形成，證明Th17具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用。 創(chuàng)新性和意義： 1.本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于觀察了隨斑塊形成T細(xì)胞亞群的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了在斑塊形成的早期Th1和Th17細(xì)胞即有升高的現(xiàn)象，通過體內(nèi)試驗(yàn)首先發(fā)現(xiàn)了IL-17的主要產(chǎn)生細(xì)胞Th17具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，為進(jìn)一步的研究動(dòng)脈粥樣硬化早期的形成機(jī)制提