Th17-IL-17途徑在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:目的：動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病涉及固有和獲得性免疫機(jī)制,近年來研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及其主要效應(yīng)因子IL-17在多種經(jīng)典的慢性炎癥免疫性疾病中發(fā)揮致病作用。臨床研究表明急性冠脈綜合征患者體內(nèi)存在Th17/IL-17途徑即Th17細(xì)胞,IL-17及RORγt等表達(dá)上調(diào)。但Th17/IL-17途徑在動(dòng)脈粥樣硬化中的具體作用尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)擬研究動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠即ApoE-/-小鼠體內(nèi)是否存在Th17/IL-17途徑相關(guān)細(xì)胞及因子上調(diào)。

2、
　　 方法：分別選取健康雄性的ApoE基因敲除小鼠（ApoE-/-）8周齡，16周齡，24周齡，32周齡各12只，以性別、體重、周齡相匹配的C57BL/6J小鼠為陰性對(duì)照，分別檢測(cè)Th17各水平指標(biāo)（包括主動(dòng)脈旁淋巴Th17細(xì)胞比例，IL-17和IL-6細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子RORγt）在ApoE-/-小鼠與C57BL/6J對(duì)照小鼠中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：ApoE-/-小鼠Th17/CD4+細(xì)胞比例、相關(guān)細(xì)胞因子(IL-1

3、7和IL-6)及轉(zhuǎn)錄因子（RORγt）在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較C57BL/6J對(duì)照小鼠上調(diào)。ApoE-/-小鼠的Th17細(xì)胞比例，相關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子在8周時(shí)即表達(dá)增加，在8-16周（動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成早中期）時(shí)達(dá)峰值，而后逐下降。
　　 結(jié)論：動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)Th17/IL-17途徑相關(guān)因子上調(diào)，提示Th17/IL-17途徑可能在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮作用。
　　 第二部分:目的：前期實(shí)驗(yàn)表明動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)有著更高水

4、平的Th17細(xì)胞，IL-17及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt，提示Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-17可能在動(dòng)脈粥樣硬化中具有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)通過抑制ApoE-/-小鼠體內(nèi)IL-17功能，觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊生物學(xué)標(biāo)志的變化，從而探討IL-17在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中的作用及可能機(jī)制。
　　 方法：8周齡健康雄性ApoE-/-小鼠每組10只,分別經(jīng)腹腔注射IL-17抗體和ratlgG2a同型，每周一次，共12周。計(jì)算各組小鼠斑塊面積；有免疫熒光

5、和Massion染色分別檢測(cè)斑塊中動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞（巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）和膠原的含量；組織化學(xué)方法用于檢測(cè)VCAM-1和MMP-9蛋白在斑塊內(nèi)的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)主動(dòng)脈局部多種細(xì)胞因子（IFN-γ, IL-17，IL-6，TNF-α，VCAM-1,IL-4和IL-10）及MMP-9的mRNA表達(dá)；流式檢測(cè)主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)Th1，Th2，Treg及Th17細(xì)胞比例。
　　 結(jié)果：IL-17抗體治療明顯減小

6、斑塊面積達(dá)47％，且顯著減少斑塊內(nèi)VCAM-1和MMP-9的蛋白表達(dá)，同時(shí)增加了斑塊內(nèi)平滑肌及膠原的含量，IL-17抗體治療亦明顯抑制主動(dòng)脈內(nèi)IL-6，TNF-α，VCAM-1等炎癥因子及MMP-9的表達(dá)，抗體治療并未影響淋巴結(jié)內(nèi)Th1，Th2，Th17及Treg細(xì)胞的比例。
　　 結(jié)論：抑制小鼠體內(nèi)IL-17能明顯減少斑塊面積，改善斑塊炎癥而增加纖維化，從而使斑塊趨于更穩(wěn)定的表型,IL-17具有促動(dòng)脈粥樣硬化作用。
　　

7、 第三部分:目的：我們發(fā)現(xiàn)Th17/IL-17途徑（Th17細(xì)胞、RORγt、IL-17和IL-6細(xì)胞因子）在ApoE-/-小鼠體內(nèi)上調(diào)，隨后，我們抑制ApoE-/-小鼠體內(nèi)IL-17能明顯減輕動(dòng)脈粥樣硬化并使斑塊斑塊中的SMCs顯著增加。在此，我們重點(diǎn)探討IL-17體外對(duì)血管平滑肌細(xì)胞（SMCs）的生物學(xué)作用，進(jìn)一步闡明IL-17在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制。
　　 方法：小鼠重組IL-17 (mrIL-17) 以不同的濃度（

8、0，50，100及200ng/ml）和時(shí)間點(diǎn)（12小時(shí)和24小時(shí)）體外單獨(dú)對(duì)小鼠SMCs進(jìn)行刺激，用Annexin/PI雙染及流式的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；mrIL-17以0，50，100及200ng/ml的濃度分別刺激SMCs 1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)和8小時(shí)，用實(shí)時(shí)定量方法檢測(cè)IL-17、IFN-γ、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、IL-6、MMP-2及MMP-9的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：IL-17能以時(shí)間和劑量依賴的方