高遷移率族蛋白B1對(duì)人T淋巴細(xì)胞免疫功能影響的體外研究.pdf

1、研究背景：膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展反映了體內(nèi)抗炎/促炎免疫平衡失控的過程，T細(xì)胞免疫活性由Th1優(yōu)勢(shì)向Th2優(yōu)勢(shì)漂移預(yù)示獲得性免疫功能抑制，形成免疫麻痹，誘發(fā)多臟器功能障礙甚至死亡，而導(dǎo)致免疫狀態(tài)呈現(xiàn)抗炎優(yōu)勢(shì)的確切原因尚待闡明。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為“晚期”炎癥因子介導(dǎo)了膿毒癥發(fā)病過程，廣泛參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)和臟器功能損害，研究其病理生理效應(yīng)和致病途徑將有助于深化對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為免疫平衡的調(diào)控提供潛在的干預(yù)目標(biāo)。本研究

2、將觀察HMGB1在體外對(duì)人T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響。 方法：分離健康人靜脈血PBMC細(xì)胞，在含10％小牛血清的1640中調(diào)整細(xì)胞濃度2×106/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。以20μg/mlPHA作為非特異性刺激劑激活細(xì)胞體外增殖。實(shí)驗(yàn)一：rhHMGB1作用劑量1～1000ng/ml，刺激時(shí)間12～48小時(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活力，觀察HMGB1對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響。采用四色流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析CD3

3、+淋巴細(xì)胞CD4表達(dá)和胞內(nèi)因子IFN-γ、IL-4分泌陽(yáng)性(Th1、Th2)的比例。實(shí)驗(yàn)二：rhHMGB1作用劑量10～1000ng/ml，刺激時(shí)間12、48小時(shí)。在rhHMGB1刺激12、48小時(shí)后收集細(xì)胞與培養(yǎng)液上清。IL-2、IL-2Rα基因表達(dá)水平的測(cè)定采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法分析。提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后以IL-2、IL-2Rα鏈為目的基因、β-actin為內(nèi)參行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳回收

4、PCR產(chǎn)物，照片判定積分光度值。上清IL-2、sIL-2R蛋白含量用ELISA法檢測(cè)。 結(jié)果：(1)500ng/ml以上劑量HMGB1作用48小時(shí)后，淋巴細(xì)胞增殖顯著抑制，低于這一劑量對(duì)增殖影響不顯著。(2)不同HMGB1刺激時(shí)間和作用劑量對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞和Th1亞群比例未造成明顯改變，但發(fā)現(xiàn)HMGB1能時(shí)間-劑量依賴性增加Th1亞群比例，并因此降低Th1/Th2比值，提示在刺激后T淋巴細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)Th1優(yōu)勢(shì)向Th2優(yōu)勢(shì)

5、偏移。(3)經(jīng)PHA激活后，T淋巴細(xì)胞IL-2、IL-2Rα基因表達(dá)和上清IL-2、sIL-2R蛋白濃度分別于12小時(shí)和24～48小時(shí)達(dá)到峰值。HMGB1與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)12小時(shí)后，10ng/ml以上劑量即可明顯上調(diào)IL-2、IL-2Rα基因表達(dá)水平與蛋白產(chǎn)生量。而HMGB1刺激持續(xù)48小時(shí)上述效應(yīng)衰竭，并表現(xiàn)出相反變化趨勢(shì)。 結(jié)論：研究證實(shí)，HMGB1對(duì)T淋巴細(xì)胞包括增殖、分化和因子分泌等免疫功能具有直接調(diào)節(jié)效應(yīng)。劑量蓄積和