高遷移率族蛋白1在急性出血壞死性胰腺炎大鼠全身毛細(xì)血管滲漏和急性肺損傷中的作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討高遷移率族蛋白1(HMGB1)在急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)大鼠全身毛細(xì)血管滲漏(SCL)和急性肺損傷(ALI)中的作用。 方法:胰管逆行灌注人工膽汁的方法復(fù)制大鼠AHNP模型。檢測AHNP大鼠血清HMGB1水平的變化規(guī)律；并觀察使用HMGB1釋放抑制劑丙酮酸乙酯(EP)下調(diào)血清HMGB1水平對(duì)AHNP大鼠生存時(shí)間的影響。 在探討與SCL關(guān)系的體外實(shí)驗(yàn)中，觀察HMGB1對(duì)單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)骨

2、架蛋白——絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)含量、分布影響的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)；以改良的Boyden小室滲漏模型研究HMGB1對(duì)單層HUVEC通透性的影響。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察下調(diào)血清HMGB1水平對(duì)AHNP大鼠SCL的影響，包括與水分滲漏和蛋白滲漏的多項(xiàng)指標(biāo)。 在探討與ALI發(fā)生時(shí)PMNs向肺部聚集的關(guān)系的實(shí)驗(yàn)中，觀察HMGB1在AHNP大鼠肺部的表達(dá)規(guī)律，rHMGB1直接氣管內(nèi)滴入對(duì)大鼠肺組織的影響以及抗HMGB1抗體氣管內(nèi)滴入

3、對(duì)AHNP大鼠肺損傷的影響，觀察rHMGB1對(duì)PMNs內(nèi)皮黏附率和穿內(nèi)皮遷移率的影響，以及rHMGB1對(duì)PMNs表面CD11a/CD18和CD11b/CD18表達(dá)的影響。 結(jié)果:（略） 結(jié)論:HMGB1作為晚期炎癥因子參與了AHNP的全身炎癥反應(yīng)，且在SCL的發(fā)生中的起到了重要的作用，其作用與影響EC骨架蛋白F-actin的含量和分布導(dǎo)致EC單層通透性增加有關(guān)。HMGB1在AHNP大鼠ALI的發(fā)生也中起到了重要作用，除影

4、響毛細(xì)血管通透性外，其作用還與上調(diào)PMNs表面CD11a/CD18和CD11b/CD18的表達(dá)，促進(jìn)PMNs黏附和游出，增加肺毛細(xì)血管的通透性有關(guān)。 HMGB1可能是防治SAP患者的CLS和ALI，降低死亡率的有效靶點(diǎn)。 第一部分急性出血壞死性胰腺炎大鼠血清高遷移率族蛋白1的變化及其意義研究 目的:探討急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)大鼠血清高遷移率蛋白-1(HMGB1)水平的變化規(guī)律，以及使用HMGB

5、1釋放抑制劑丙酮酸乙酯(EP)下調(diào)其水平對(duì)大鼠生存時(shí)間的影響。 方法:采用胰管逆行灌注人工膽汁的方法復(fù)制大鼠AHNP模型。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal組)、急性出血壞死性胰腺炎組(AHNP組)、EP治療組(EP組)。EP組建模12h開始使用EP治療。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測各組動(dòng)物血清TNF-αL、IL-1β水平。Westernblot法檢測血清HMGB1水平。 另設(shè)實(shí)驗(yàn)組研究EP對(duì)AHNP大鼠生存時(shí)間的影響。

6、結(jié)果:（略） 結(jié)論:HMGB1作為晚期炎癥因子參與了AHNP的全身炎癥反應(yīng)。使用EP下調(diào)AHNP大鼠血清HMGB1水平，能顯著延長動(dòng)物生存時(shí)間。 第二部分高遷移率族蛋白1在急性出血壞死性胰腺炎大鼠全身毛細(xì)血管滲漏發(fā)生中的作用研究 目的:探討高遷移率族蛋白1(HMGB1)在急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)大鼠全身毛細(xì)血管滲漏(SCL)發(fā)生中的作用。 方法:在體外實(shí)驗(yàn)中觀察了HMGB1對(duì)單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(

7、HUVEC)骨架蛋白——絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)含量、分布的影響以及對(duì)單層HUVEC通透性的影響，在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察下調(diào)血清HMGB1水平對(duì)AHNP大鼠SCL的影響。 1.體外實(shí)驗(yàn)采用成熟的方法分離培養(yǎng)鑒定HUVEC。向單層HUVEC培養(yǎng)液中加入不同濃度梯度(0、10、100、1000、10000ng/ml)的rHMGB1，培養(yǎng)12h以觀察HMGB1作用的劑量效應(yīng)；加入100ng/ml的rHMGB1，分別培養(yǎng)1、6、12

8、和24h，以觀察HMGB1作用的時(shí)間效應(yīng)。F-actin用羅達(dá)明-鬼筆環(huán)肽染色，熒光顯微鏡下觀察F-actin的細(xì)胞內(nèi)分布，流式細(xì)胞儀檢測HUVEC內(nèi)F-actin的含量。另外，采用Boyden小室滲漏模型、伊文氏藍(lán)結(jié)合的牛血清白蛋白評(píng)價(jià)單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。在上室中加入0、10、100、1000ng/ml濃度的rHMGB1培養(yǎng)12h以觀察HMGB1作用的劑量效應(yīng)；或加入100ng/ml濃度的rHMGB1培養(yǎng)1、6、12、24h以觀

9、察HMGB1作用的時(shí)間效應(yīng)。 2.體內(nèi)試驗(yàn)采用胰管逆行灌注人工膽汁的方法復(fù)制大鼠AHNP模型。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal組)、假手術(shù)組(Sham組)、AHNP組、EP組。EP組建模12h開始使用EP治療。檢測與水分滲漏相關(guān)的肺系數(shù)、肺濕/干比、腹水量。使用伊文氏藍(lán)(EBD)尾靜脈注射檢測與蛋白滲漏相關(guān)的胰腺、空腸、回腸、心肌、耳廓組織EBD含量等多項(xiàng)指標(biāo)。 結(jié)果:1.HMGB1通過影響HUVEC骨架蛋白F-acti

10、n的含量和分布導(dǎo)致HUVEC單層通透性增加，而且具有明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)：正常HUVEC單層表現(xiàn)為細(xì)胞間連接緊密，圓滑，F(xiàn)-actin主要分布在細(xì)胞周邊、胞膜內(nèi)側(cè)，隨著HMGB1作用濃度和作用時(shí)間的增加，對(duì)HUVEC單層F-actin的影響逐漸加重，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為從胞漿內(nèi)出現(xiàn)應(yīng)力纖維，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的F-actin纖維致密斑減少，到大部分細(xì)胞發(fā)生肌動(dòng)蛋白重組，細(xì)胞邊緣有絲狀偽足出現(xiàn)，偶有板狀偽足形成，細(xì)胞間連接有縫隙形成，更甚者出現(xiàn)大量典型

11、的板狀偽足，最終肌動(dòng)蛋白絲的溶解、消失；含量上表現(xiàn)為F-actin逐漸減少。HUVEC單層的通透性也出現(xiàn)類似的變化，表現(xiàn)為通透性逐漸增加。 2.下調(diào)血清HMGB1水平可有效減輕AHNP大鼠SCL的程度：建模后24h，EP組血清HMGB1濃度明顯低于AHNP組。EP組大鼠腹水量、肺系數(shù)、肺濕/干比明顯低于AHNP組，胰腺、空腸、回腸和耳廓組織EBD含量明顯低于AHNP組。 結(jié)論:HMGB1在AHNP發(fā)生SCL中的起到了重要

12、的作用，其作用可能與影響EC骨架蛋白F-actin的含量和分布導(dǎo)致EC單層通透性增加有關(guān)。HMGB1可能是防治SAPSCLS的有效靶點(diǎn)。 第三部分高遷移率族蛋白1在急性出血壞死性胰腺炎大鼠急性肺損傷發(fā)生中的作用研究 目的:探討高遷移率蛋白-1(HMGB1)在急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)大鼠急性肺損傷(ALI)發(fā)生中的作用。 方法: 1.胰管逆行灌注人工膽汁的方法復(fù)制大鼠AHNP模型。從肺組織

13、TNF-α和HMGB1的mRNA表達(dá)水平，支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清TNF-α和HMGB1水平觀察HMGB1在AHNP大鼠肺部的表達(dá)規(guī)律。免疫組化檢測肺內(nèi)HMGB1的表達(dá)部位。 2.觀察rHMGB1(10、100μg)直接氣管內(nèi)滴入對(duì)大鼠肺損傷組織學(xué)評(píng)分、動(dòng)脈血氧分壓、肺濕/干比、肺組織TNF-α含量和MPO活性的影響。 3.分離培養(yǎng)大鼠PMNs和PCEC。觀察0、10、100、1000、10000ng/ml濃度

14、的rHMGB1對(duì)PMNs內(nèi)皮黏附率的影響。以Boyden小室遷移模型研究上述濃度的rHMGB1對(duì)PMNs穿過PCEC遷移到EC下及下室的遷移率的影響。將PMNs與100ng/ml的rHMGB1孵育，流式檢測其對(duì)CD11a/CD18和CD11b/CD18表達(dá)的影響。 4.觀察抗HMGB1抗體對(duì)AHNP大鼠上述ALI指標(biāo)——大鼠肺損傷組織學(xué)評(píng)分、動(dòng)脈血氧分壓、肺濕/干比、肺組織勻漿TNF-α含量和MPO活性的影響。 結(jié)果:

15、 1.AHNP大鼠肺組織HMGB1表達(dá)上調(diào)：肺組織TNF-α和HMGB1的表達(dá)上調(diào)均早于它們?cè)谘逯械谋磉_(dá)上調(diào)，而在肺組織和血清中TNF-α的表達(dá)均早于HMGB1，但HMGB1升高后持續(xù)時(shí)間較長。肺組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，ALI的高峰在建模后12h，此時(shí)肺組織TNF-α的水平均早已下調(diào)，ALI持續(xù)加重與HMGB1有關(guān)。正常大鼠肺組織HMGB1主要表達(dá)在肺巨噬細(xì)胞(包括肺泡巨噬細(xì)胞和肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞)和終末支氣管的上皮細(xì)胞。AHNP大鼠還

16、在聚集的PMNs中表達(dá)。 2.rHMGB1氣管內(nèi)滴入可造成大鼠典型的急性肺損傷表現(xiàn)：10μg和100μgrHMGB1氣管內(nèi)滴入可增加大鼠肺損傷組織學(xué)評(píng)分、肺濕/干比、肺組織勻漿TNF-α含量和MPO活性，使用100μgrHMGB1的大鼠動(dòng)脈血氧分壓明顯降低。 3.HMGB1不是PMNs的趨化因子，但可明顯增加PMNs對(duì)PCEC的黏附率和穿過PCEC的游出率：隨著rHMGB1濃度的增加，PMNs的黏附率和穿過PCEC的游出

17、率逐漸增加，但對(duì)向下室的遷移率無影響。rHMGB1可顯著提高PMNs表面CD11a/CD18和CD11b/CD18的表達(dá)。 4.HMGB1抗體氣管內(nèi)滴入可減輕AHNP大鼠的ALI表現(xiàn)：降低AHNP大鼠肺損傷組織學(xué)評(píng)分、肺濕/干比和MPO活性，增加動(dòng)脈血氧分壓，但對(duì)肺組織TNF-α含量無明顯影響。 結(jié)論:HMGB1在AHNP大鼠ALI的發(fā)生中起到了重要作用，其作用可能與上調(diào)PMNs表面CD11a/CD18和CD11b/CD