高遷移率族蛋白1在1型糖尿病鼠胰島β細胞損傷中的作用機制.pdf

1、1型糖尿病(type1 diabetes mellitus，T1DM)，又稱胰島素依賴型糖尿病或青少年糖尿病，目前普遍的觀點認為是免疫學因素、基因和環(huán)境等因素共同參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展的結果，其主要特點是細胞介導的胰島β細胞的損傷。
　　 上世紀七十年代初發(fā)現的高遷移率族蛋白1(high-mobility group box1，HMGB1)，被認為是一種重要的調控轉錄的核蛋白。HMGB1可使DNA彎曲并促使一些調節(jié)蛋白復合物同D

2、NA結合而發(fā)揮作用。此外，HMGB1還參與了許多與炎癥及組織損傷有關的自身免疫性疾病，如類風濕性關節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)及系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)。許多重要的受體參與了HMGB1信號通路，包括toll樣家族受體(toll-like family ofreceptors，TLRs)及晚期糖基化終產物受體(the receptor for advance

3、d glycation endproducts，RAGE)。HMGB1通過TLRs或RAGE活化核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)發(fā)揮作用，從而誘導促炎細胞因子的生成、白細胞粘附分子的上調、導致組織損傷及炎癥反應。
　　 盡管胰島α細胞圍繞在胰島β細胞的外周并形成天然的物理屏障，然而在T1DM的發(fā)病過程中，胰島α細胞卻幾乎不受影響，而胰島β細胞則明顯受損。非肥胖糖尿病(non-obese diabet

4、ic，NOD)小鼠可以自發(fā)產生T1DM，且同人類T1DM的發(fā)病特點相似，是國際公認的T1DM模型。HMGB1參與了許多自身免疫性疾病的發(fā)病過程，T1DM也是一種自身免疫性疾病，然而，HMGB1是否參與了T1DM的發(fā)病過程及其可能的作用機制，目前國內外尚未見報道。
　　 本研究用免疫組化技術檢測HMGB1在NOD小鼠胰腺中的分布后發(fā)現，在發(fā)病NOD小鼠胞漿中。HMGB1的陽性率明顯高于未發(fā)病組，提示HMGB1可能參與了T1DM的發(fā)

5、病過程。進一步檢測NOD小鼠不同胰島細胞表面HMGB1受體的分布情況，證實了HMGB1可以同胰島細胞表面的TLR4相互作用，且TLR4主要表達于β細胞而非α細胞。接著用基因表達譜芯片檢測NOD小鼠糖尿病發(fā)病過程中的基因變化。最后闡明HMGB1選擇性損傷胰島β細胞的TLR4信號通路的作用機制。
　　 第一部分 NOD小鼠在T1DM發(fā)病過程中HMGB1的分布和變化特性
　　 目的檢測HMGB1在NOD小鼠胰腺中的表達、T1D

6、M發(fā)病過程中的變化及在胰島細胞表面其相關受體的分布。
　　 方法用NOD小鼠建立T1DM模型，每周檢測血糖變化，蘇木精-伊紅(hematoxylinand eosin，HE)染色觀察發(fā)病過程中胰島的變化，胰島素染色、激光共聚焦技術檢測未發(fā)病NOD小鼠和發(fā)病NOD小鼠胰島免疫熒光染色結果，并統計胰島數目。HMGB1染色并用免疫組化檢測HMGB1的多少與胰島損傷輕重的關系。激光共聚焦技術進一步檢測NOD小鼠胰腺胰島細胞不同細胞表面H

7、MGB1受體的表達情況。
　　 結果(1)雌性NOD小鼠最早于4周開始發(fā)病，14周～26周發(fā)病明顯增加，至30周的累積發(fā)病率為70％；HE染色鏡下觀察，未發(fā)病NOD小鼠胰腺內可見大小不等的胰島細胞，細胞呈團索狀分布，胰島結構完整，細胞飽滿，細胞間有豐富的毛細血管，胰島內未見單核細胞或淋巴細胞浸潤；發(fā)病小鼠胰島變性、壞死消失，胰島體積變小、萎縮，胰島內細胞數量較少，纖維組織增生及玻璃樣變；(2)免疫熒光激光共聚焦技術檢測：未發(fā)病N

8、OD小鼠胰腺可見胰島β細胞區(qū)域有大量胰島素陽性的紅色熒光，胰島結構完整、細胞飽滿，紅色熒光區(qū)域較廣，而發(fā)病NOD小鼠胰島β細胞區(qū)域僅出現少量胰島素陽性的紅色熒光，較分散，且分布區(qū)域較小；胰島計數：未發(fā)病NOD小鼠胰島數目較多，發(fā)病的NOD小鼠胰島數目明顯減少，由42.5±4.90銳減至30.85±9.24，與未發(fā)病組相比有顯著的統計學差異(P<0.01)；(3)HMGB1免疫組化染色結果顯示：未發(fā)病NOD小鼠胰腺組織HMGBl蛋白主要定

9、位于胞核，發(fā)病NOD小鼠胰島損傷明顯加重，HMGB1蛋白向胞外釋放明顯增多。通過鏡下計數得到HMGB1從胞核向胞漿的轉移率發(fā)現，隨著NOD小鼠周齡的增加，T1DM癥狀的加重，胰腺組織中位于胞外的HMGB1明顯增加，HMGB1轉移率由19.44±5.08上升到79.22±6.92，組間差異有顯著統計學差異(P<0.01)；(4)激光共聚焦技術檢測NOD小鼠胰腺組織胰島細胞表面HMGB1受體，TLR2、TLR4、TLR9和RAGE的免疫熒光

10、表達情況：4周未發(fā)病NOD小鼠胰腺胰島細胞表面，幾乎所有的胰島β細胞膜表面均表達TLR4，TLR4主要定位在胞膜，呈綠色熒光，而TLR2、TLR9和RAGE的表達量則很低，甚至完全不表達；(5)進一步檢測胰島α及β細胞表面TLR4的表達情況：分別用胰高血糖素及胰島素標記4周未發(fā)病NOD小鼠胰腺的胰島α及β細胞，采用免疫熒光雙重染色標記方法同時檢測TLR4在胰島α細胞及β細胞上的表達情況。TLR4主要分布于構成胰島主體的β細胞表面。胰高血

11、糖素陽性的胰島α細胞呈環(huán)狀圍繞在胰島周圍，其表面僅能看到極少量的TLR4陽性的細胞。
　　 結論隨著1型糖尿病的進展，HMGB1表達量明顯增加，其可能通過免疫機制參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展過程；幾乎所有的胰島細胞表向均表達TLR4，而TLR2、TLR9和RAGE的表達量則很低；胰島β細胞上HMGB1受體TLR4的表達較α細胞多，對損傷更敏感。
　　 第二部分 NOD小鼠T1DM發(fā)病過程中的基因變化的芯片測定
　　 目

12、的基因表達譜芯片檢測NOD小鼠糖尿病發(fā)病過程中的基因變化。
　　 方法經膽管穿刺，逆行灌注1.5～2 ml4℃的膠原酶V，分離NOD小鼠的胰腺。將胰腺放入含膠原酶V的D-Hank's平衡液中，并置于37℃恒溫水浴箱中振蕩消化。將消化液用含5％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI1640清洗三遍后用Ficoll分離液進行純化。分離好的胰島進一步用毛細吸管手工分選，用Dithizone(DTZ)將胰島特

13、異性染為腥紅色進行鑒定以保證胰島細胞的純度；分別提取未發(fā)病及發(fā)病NOD小鼠胰島的總RNA，用NanoDrop ND-1000分光光度計及標準的變性瓊脂糖凝膠電泳進行樣品的質量控制；每組取5μg RNA用于標記及芯片雜交。將掃描得到的圖像導入NimbleScan軟件(VER2.5)做表達數據等相關分析。通過倍比差異法(fold change filtering)分析表達不同的基因；使用標準富集計算方法(standard enrichmen

14、t computation method)對表達水平不同的基因行基因本體論(gene ontology，GO)分析及信號通路分析；分層聚類法(Hierarchical clustering)分析兩組基因的表達差異。
　　 結果(1)Ficoll法分離后仍有少量胰腺外分泌細胞和導管細胞。用毛細吸管將胰島細胞手工挑選出來后，并將純化后的胰島細胞行DTZ染色，在倒置顯微鏡下觀察：剛分離的胰島，細胞呈圓形或橢圓形，形態(tài)完整，有折光性。經

15、DTZ染色后見約95％的細胞團呈猩紅色，證明分離的胰島純度很高；從電泳圖上可以看到三條清晰的5S、18S、28S核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)條帶，且28s rRNA的亮度為18s rRNA的兩倍。并且OD260/OD280比值均在1.9～2.0之間，提示總RNA質量很好；(2)同Roche NimbleGen公司含44170個基因的基因組表達譜芯片雜交，將上述掃描得到的圖像導入NimbleScan軟件(VER2.

16、5)，將原始數據標準化，剔除掉表達程度過低的基因，做表達數據等相關分析，共得到1007條差異表達基因，其中上調基因432條，下調基因575條；(3)做箱形圖(box plot)比較所有樣品的強度分布，可快速可視化數據集的分布；將發(fā)病NOD小鼠組和未發(fā)病NOD小鼠組的芯片雜交圖完全重疊，重疊后的圖像用專業(yè)軟件進行分析，得到芯片雜交的散點圖，來評估兩組樣品之間基因表達變化(或重復性)；(4)GO分析從生物學過程、分子功能和亞細胞組分三個方面

17、對基因的功能進行分類，每個大類又可分為下一級及更下一級的分支，結果顯示：在生物學過程中，有885(87.7％)個與代謝相關的基因上調；22(18.97％)個與代謝有關的基因和21個(18.10％)與催化活性(regulation of catalytic)相關的基因下調；在細胞組分方面，上調基因分布比較平均，最高的為細胞及細胞成分，占488個(29.20％)；下調基因主要為細胞骨架(cytoskeleton)、微管細胞骨架(micotu

18、bule cytoskeleton)及相關組分57個(78.08％)；上調的分子功能相關基因中，有591個(84.07％)與結合(binding)有關。下調的分子功能相關基因主要為44個(30.77％)水解酶活性(hydrolase activity)、17個(11.89％)酶調節(jié)活性(enzyme regulatoractivity)；(5)倍比聚集法(fold enrichment)分析后，發(fā)現在生物學功能中，上調最明顯的是細胞核凋

19、亡過程中形成的DNA碎片(DNA fragmentation)及DNA的分解代謝過程(DNA catabolic process)，下調最明顯的是軟骨細胞的分化調節(jié)能力；細胞組分方面，上調最明顯的是肌球蛋白復合物(myosin complex)和內含體(endosome)，下調最明顯的是肌球蛋白復合物Ⅱ和細胞質動力蛋白(cytoplasmic dynein complex)；在分子功能中，上調最明顯的是脫氨酶活性，下調最明顯的是Rac

20、GTP酶活化活性(Rac GTPaseactivator activity)；(6)Pathway分析NOD小鼠T1DM發(fā)生過程中明顯上調的信號通路為黏蛋白型O聚糖合成信號通路(mucin type O-Glycan biosynthesis)，基因下調的信號通路主要為血管加壓素信號通路(vasopressin-regulated waterreabsorption)；通過分析與本課題相關的基因，發(fā)現TLR4信號通路中含TIR的接頭蛋白

21、(TIR domain-containing adapter protein，TIRAP)及下游信號分子被激活。
　　 結論在T1DM的發(fā)病過程中，多條信號通路被激活；通過分析與本課題相關的基因，發(fā)現TLR4信號通路中TIRAP及下游信號分子被激活。
　　 第三部分
　　 HMGB1選擇性損傷胰島β細胞的TLR4信號通路
　　 目的 HMGB1如何同胰島β細胞的TLR4結合及其參與損傷胰島β細胞的機制。<

22、br>　　 方法分離并純化未發(fā)病NOD小鼠胰島后體外培養(yǎng)；不同劑量HMGB1干預后用TUNEL法檢測胰島細胞的凋亡情況；為進一步研究HMGB1同其相對應受體的結合能力，將胰島細胞先分別同TLR2、TLR4、TLR9及RAGE抗體預孵育后再同NHS-Fluorescein標記的HMGB1孵育，并用激光共聚焦技術檢測其結合能力；用Western Blotting技術檢測NOD小鼠發(fā)病不同時期胰腺HMGB1及TLR4蛋白的表達；用實時熒光定

23、量PCR技術對NOD小鼠糖尿病發(fā)病全程胰腺HMGB1及TLR4 mRNA表達水平進行測定；通過ELISA技術檢測小鼠外周血血清中炎癥細胞因子濃度的改變，進而了解全身性炎癥反應水平的變化情況。
　　 結果(1)不同濃度HMGB1干預，TUNEL法檢測凋亡：高濃度HMGB1(15μg/mE)組胰島細胞內TUNEL陽性的胰島細胞核數為(20.31±2.36)，較低濃度HMGB1(10μ g/mL)組胰島細胞內TUNEL陽性的胰島細胞核

24、數(5.56±1.71)及HMGB1(5μ g/mE)組胰島細胞內TUNEL陽性的胰島細胞核數(2.86±1.36)明顯增加，組間有明顯統計學差異(P<0.01)，且HMGB1同凋亡數成正比，表明HMGB1可以促進胰島細胞的凋亡；(2)HMGB1可以與胰島細胞表面的TLR4特異性結合：胰島細胞分別同TLR2、TLR9、RAGE或IgG預孵育后并不影響胰島細胞同HMGB1的結合，然而，同IgG處理過的對照組相比，用TLR4抗體及未標記HM

25、GB1預孵育后明顯降低了胰島細胞同HMGB1的結合能力。上述結果提示：HMGB1可以同胰島細胞表面的TLR4相互作用；(3)用Western Blotting及實時熒光定量PCR技術分別從蛋白水平及信使RNA水平檢測NOD小鼠在自然發(fā)病過程中HMGB1及TLR4表達量的變化趨勢。Western Blotting檢測發(fā)現：在未發(fā)病NOD小鼠中HMGB1及TLR4蛋白的表達量較低，而在發(fā)病早期(10W～14W)其表達量明顯增加(P<0.01

26、)，在疾病晚期，HMGB1及TLR4蛋白的表達明顯下調(P<0.01)；在NOD小鼠糖尿病的發(fā)病過程中，每3周～5周檢測胰腺HMGB1及TLR4 mRNA的表達變化。分析結果表明：8周以前的NOD小鼠其胰腺中HMGB1 mRNA的表達無明顯變化。然而，在10周時，胰腺中HMGB1 mRNA的表達水平顯著升高，上升程度約為4周時的(8.83～11.59)倍，然后緩慢下降直至接近于8周HMGB1 mRNA的水平。NOD小鼠TLR4 mRNA

27、的表達同HMGB1mRNA變化趨勢相近，6周時NOD小鼠TLR4 mRNA的表達水平較4周時明顯升高。然而這一過程很短暫，在接下來的8周至10周，TLR4 mRNA的表達量持續(xù)上升，定量分析提示，第10周時其表達水平約為第4周的(14.03～8.58)倍，而后其表達水平逐漸下降。Western Blotting及實時熒光定量PCR數據表明：胰島β細胞表面TLR4的過表達同T1DM的進展及HMGB1的表達密切相關。(4)ELISA結果提示

28、，與未發(fā)病組相比，發(fā)病組NOD小鼠外周血中白介素(interleukin，IL)-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.05)及干擾素(interferon，IFN)-γ(P<0.01)的濃度均出現不同程度的上升。以上數據表明，隨著T1DM的進展，HMGB1、TLR4的過表達、二者結合后導致TLR4信號通路的激活，能夠改變全身性炎癥細胞因子的分泌特征，增加促炎細胞因子的分泌，提高T1DM時機體內的抗炎水平。
　　 結論 TLR

29、4是胰島β細胞表面的主要受體，在T1DM的發(fā)病過程中，HMGB1可以選擇性地同胰島β細胞而不是胰島α細胞結合，選擇性損傷胰島β細胞；胰島β細胞表面TLR4的過表達同T1DM的進展及HMGB1的表達密切相關。TLR4在胰島β細胞中不僅表達上調，而且發(fā)揮著相應的功能，激活的TLR4信號通路可通過活化IL-1β、IL-6、IFN-γ等下游炎癥因子，引起局部炎癥樣反應，達到選擇性破壞胰島β細胞并使其功能衰竭，最終導致體內胰島素分泌不足，糖尿病癥